基于不同传感器的纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量检测技术评价

李文涛，杨江波，张绩，王克健，邓烈，吕强，何绍兰，谢让金，郑永强，马岩岩，易时来

（西南大学柑桔研究所/中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712）

0　引言

【研究意义】叶绿素是植物体内与光合作用、碳水化合物合成水平相关的关键因素，其含量是表征植物生长的重要指标，且叶片的叶绿素含量与氮含量有显著的正相关性[1]。及时诊断和了解柑橘植株的叶绿素含量水平，对于果园营养诊断、生产能力评估和施肥决策等具有重要的指导意义。传统的叶绿素含量测定方法-分光光度法，存在破坏植株组织、分析过程复杂和实时性差等缺点，因此探索建立轻简、高效多元化的叶绿素含量检测技术体系具有重要意义。【前人研究进展】近年来，关于作物叶绿素含量的快速检测研究较多，国内外试验表明，SPAD可作为叶绿素含量快速检测的可靠手段，可替代叶片叶绿素含量评价氮素营养状况，指导生产施肥[2-3]。基于光谱技术的检测方法成为农业信息技术的研究热点，并在小麦、水稻、果树等方面取得了较好的进展。PINAR 等[4]、GITELSON 等[5]、LAMB 等[6]的研究发现，红边位置能较好的反映叶片叶绿素含量；王雪[7]、张浩[8]等通过高光谱和多光谱技术进行小麦、水稻叶绿素含量快速检测，并获得相关优化检测模型。除光谱技术外，一些研究者提出将数字图像技术应用于植株营养状况监测，BLACKMER等[9]利用图像技术建立了玉米作物叶片叶绿素含量预测模型；易时来等[10]采用图像技术建立了锦橙叶片 SPAD值预测回归模型。而YADAV[11]和GUPTA等[12]采用扫描仪（HP scan jet 3670）作为信息采集器，以b/L参数值建立土豆叶片叶绿素含量预测回归模型。法国Force-A公司生产的植物荧光及多酚含量测量仪Multiplex®Research也可代替 SPAD 叶绿素仪，应用于无损、快速评估叶片叶绿素含量及氮素营养状，Multiplex®Research主要基于多重激发光源（紫外线、蓝光、绿光和红光）瞬间无损测定叶片叶绿素含量、类黄酮含量、花青素含量、紫外线和绿光激发下的氮素平衡指数以及紫外线和红光激发下的氮素平衡指数等参数[13-14]。【本研究切入点】目前，关于地物光谱仪、数字图像、荧光及多酚含量测量仪等不同传感器系统监测与评估柑橘叶绿素等生理指标的研究应用未见报道。本研究系统比较评估3种传感器对纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量检测模型的优劣，建立不同传感器的柑橘叶片叶绿素检测诊断技术方法，为柑橘树体营养生理与长势状况监测提供一种实时、便捷的技术。【拟解决的关键问题】本试验以 SPAD-502叶绿素仪测定值为叶绿素含量基础数据，采用Multiplex®Research荧光多酚含量测量仪、普通扫描仪（HP Scanjet G4050）、ASD FieldSpec4地物光谱仪作为信息采集器，建立纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量预测模型，对比评价不同传感器的可行性与预测精度，为构建柑橘园养分精准管理技术体系提供了依据。

1　材料与方法

1.1　试验设计

以重庆市北碚区歇马镇西南大学柑桔研究所（中国农业科学院柑桔研究所）日光温室内砂培二年生枳砧纽荷尔脐橙为试验材料，2016年6月单株定植于圆柱体盆钵（规格：上口直径×高×下底直径为28 cm×31 cm×22 cm）中，基质为河沙和珍珠岩1∶2混合。试验共设7个氮水平，施用量为N0（0）、N1（纯氮12.5g/株）、N2（纯氮 25 g/株）、N3（纯氮 37.5 g/株）、N4（纯氮50 g/株）、N5（纯氮60 g/株）、N6（纯氮70 g/株），每个处理10株。施肥处理时间为2016年6月至2016年10月，氮肥采用含氮量为46%的尿素，每月施总量的五分之一，其余元素使用改良Hogland营养液补充。2016年11月选取57株生长健康的柑橘植株（覆盖7个处理），单株采集当年生春梢自顶部起的第3片叶，20片为一个样本。所有叶片用蒸馏水清洗干净并擦干，备用。

1.2　数据采集与指标测定

1.2.1反射光谱采集叶片高光谱反射率采用美国ASD公司生产的地物光谱仪FieldSpec 4 Standard-Res室内测定。主要原理是利用植株营养元素的丰缺可直接影响其生理代谢过程，使得叶片内生化成分及其浓度产生差异，引起生化成分的化学键的振动情况不同，在可见-近红外波段范围内表现出特别的光谱特性，进而快速测定样品中的元素含量。波长范围 350—2 500 nm，光谱分辨率3 nm@700 nm、10 nm@1 400/2 100 nm，采样间隔1.4 nm@350—1 025 nm、2 nm@1 025—2 500 nm，共2 151通道，扫描时间100 ms。使用叶片夹装置采集叶片光谱信息，测量前采用标准黑板进行仪器暗电流校正以及标准白板标定。每个单叶重复采集 3次光谱曲线，每次光谱采集设置为 10条曲线，将每个样本所有采集的30条曲线取平均值作为该样本的最终光谱值。

1.2.2图像信息获取使用惠普扫描仪（HP Scanjet G4050）作为信息采集器，主要原理为植物叶片颜色的变化实质上是植物体内叶绿素及其他色素含量变化引起的。叶片的颜色与叶绿素含量有着密不可分的关系，故人们往往把叶片颜色变化作为判断作物营养和缺素症发生的直接依据。本试验扫描参数设置为每英寸 300像素，24位颜色深度。用 Adobe Photoshop CS6软件提取叶片图像的R、G、B参数值，并对R、G、B进行各种形式的变换组合，作为颜色特征参数。同时对R、G、B值进行归一化处理，即色度坐标r、g、b，消除不同环境条件下光强等差异所造成误差的颜色分量，其中r、g、b的计算公式分别为：r=R/(R+G+B)，g=G/(R+G+B)，b=B/(R+G+B)，且 r+g+b=1[15]。

1.2.3荧光参数获取叶片紫外-可见光荧光信息采用法国Force-A公司研制生产的手持式植物荧光及多酚含量测量仪Multiplex®Research测定。主要原理为利用多酚物质和叶绿素对特定波长光的吸收和反射特性，测出其在植物中的含量。该仪器有紫外（UV，375 nm）、蓝（B，470 nm）、绿（G，516 nm）、红光（R，630 nm）4个激发通道，蓝光（BGF，447 nm）、红光（RF，685 nm）、远红外光（FRF，735 nm）3个探测通道[16-17]。其中红光激发光透过表皮，在叶绿素中激发出近红外荧光，紫外光或蓝绿光被表皮中多酚物质部分吸收，并激发出少量叶绿素荧光，在不同激发光和荧光的组合下获得12种测量参数，以及自身程序运算后得到36个参数。根据测定环境光强选择LEDs功率大小，由于为室内测试，设置LEDs功率大小为cfg2。测定过程叶片完全覆盖采样孔，且避免阳光或灯光等外源直射光源进入采样孔内，每个样本所有单叶片荧光值取平均值分析。

1.2.4叶绿素含量测定每片叶片样本采集完光谱信息后立即使用日本 MINOLTA公司研制生产的SPAD-502型叶绿素计测定叶绿素含量，每片叶测定10个部位（避开主叶脉）的SPAD值，取其平均值作为该叶片的叶绿素含量。

1.3　数据处理

叶片光谱反射率由美国ASD（Analytical spectral devices, Boulder，USA）RS3和ViewSpecPro软件采集转换获得。因光谱信号容易受到测量环境和仪器性能等因素的影响，为减少光程变化、样品粒度、基线平移与旋转可能对模型建立的干扰，利用Unscrambler V9.7（CAMO AS，Oslo，Norway）对原始光谱数据进行移动平滑（MAS）、一阶导数光谱（FDS）、二阶导数光谱（SDS）、多元散射校正（MSC）、归一化（Normalize）、标准归一化处理（SNV）、Noise以及相互组合等方法进行预处理[18-19]。其他数据采用Microsoft Office Excel 2010、Matlab2010b统计分析。

1.4　模型构建与精度评价

将Multiplex®Research叶片荧光值、地物光谱仪FieldSpe4光谱值、图像色彩参数值作为自变量，分析其与叶片相对叶绿素含量的数学关系，并使用偏最小二乘法（partial least squares，PLS）及内部交叉验证方法建立叶片叶绿素含量预测模型，并检验模型的拟合度。偏最小二乘法（PLS）是基于线性回归方式的多元校正方法，可消除噪声，解决光谱共线问题，有效地提取光谱信息，综合多元线性回归、典型相关分析和主成分分析等优势，是化学计量中最普遍使用的定量分析法[20-21]

本试验所采用的模型性能优劣评价指标为主成分数（principal components）、相关系数（correlation coefficient，r）、交叉验证均方根误差（root mean square error of cross validation，RMSE-CV)、预测均方根误差（root mean square error of prediction，RMSE-P）、平均相对误差（mean relative error，MRE）和残余预测偏差（residual prediction deviation，RPD）即测定值标准差与标准预测误差的比值[22-23]。r和RPD反映出预测值与实测值之间的相关性强度，RMSE和MRE反映出预测值与实测值之间的偏差。r和RPD的值越大、MRE值越小，表明模型的稳定性与可靠性越好、预测能力越强。且当 RPD＞2时，表明模型具有很好的预测能力；1.4＜RPD＜2.0时，说明模型可对样品做粗略估算；RPD＜1.4时，表明模型无法对样品进行预测[24]。

2　结果

2.1　不同氮处理对纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量的影响

不同氮处理纽荷尔脐橙叶片的 SPAD值的测定结果如图1所示。结果表明，N2处理的叶绿素含量显著高于其他处理。相比于N0处理，增施氮肥可显著提高纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量。随着氮肥施用量的增加，在一定范围内叶片叶绿素含量呈递增趋势，N2处理达到最大值，此后随着氮肥施用量的增加，叶片叶绿素含量呈递减趋势。本试验将所有样本通过Matlab2010b GUI_SPA Kennard-Stone（K-S）分类法[25]，按照校正集∶预测集=3∶1随机分配，其中校正集样品的SPAD值范围为69.1—85.6，预测集样品SPAD值范围为73.3—85.1，预测集样本叶绿素含量均在校正集样本含量范围之内，可以用于模型预测及精度检验。

图1　不同氮处理的纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量Fig. 1　The SPAD values of Newhall Navel Orange leaves under different N treatments

2.2　基于高光谱反射率的纽荷尔脐橙叶片叶绿素反演

叶片是制造光合产物的重要来源，植物氮素的丰缺直接影响生理代谢过程，引起不同的化学键振动情况，致使不同波段上光谱反射率存在差异。图2为不同氮处理的叶片反射光谱数据分别作平均处理所得到的曲线图，其中波段400—700 nm为植物叶片的强吸收波段，反射率很低；由于叶绿素在红波段的强吸收和近红外波段的多次散射，在700—800 nm波段形成高反射平台的过渡区域；910—2 350 nm存在植物叶片中水分、蛋白质、氮素、淀粉等生物化学成分的吸收特征。由图2可看出，不同氮处理的各波段的反射光谱曲线动态变化趋势相同，但某些波段区域存在一定的反射强度差异。其中，N5处理的叶片光谱反射率均值在500—650 nm、1 100—1 300 nm、1 410—2 500 nm左右明显高于其他处理。在500—650 nm各氮处理叶片反射率存在明显差异，且随着叶绿素含量的升高呈递减趋势。因此，可通过叶片叶绿素含量光谱响应特征，采用化学计量学方法建模对未知样品叶绿素含量进行预测。

将所有叶片的高光谱数据经过8种预处理方法转换，建立叶绿素含量的偏最小二乘回归模型，所有模型预测精度结果如表1所示。从表1可以看出，部分预处理后的光谱数据建立模型，预测集相关系数显著提高。但并不是所有预处理都可以提高模型精度，如Noise法所建模型效果相对于原始光谱数据所建模型较差。综合多指标可得出以FD法建立的反演模型效果最优，模型精度高，可以较好预测纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量。

通过全波长特征波段的筛选，采用特征波段建模可有效减少模型输入量，减少冗余信息，提高模型运行效率[26]。相关性分析是确定地物特征波段的重要方法之一，对比分析所有不同预处理方法建立的模型精度，采用最优预处理FD法转化后的光谱数据进行特征波段的筛选。图3显示了FD预处理法全波段光谱数据与纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量相关性曲线，结果表明，经FD预处理后全波段光谱数据与纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量相关性曲线在532 nm、586 nm与705 nm附近出现明显高峰，且相关系数均达0.8以上，达极显著相关。选择此3个波长作为特征波长构建 PLS模型，其中校正集 rc=0.834，RMSE-CV=2.390，预测集 rp=0.940，RMSE-P=1.851，MRE=1.80%，RPD=3.801。

表1　纽荷尔脐橙叶片SPAD值反射光谱预测模型结果Table 1　The model accuracy of SPAD value based on hyperspectral reflectance

图2　不同氮处理的纽荷尔脐橙叶片光谱响应特征Fig. 2　The spectral characteristics of Newhall Navel Orange leaves under different treatments

2.3　基于荧光值的纽荷尔脐橙叶片叶绿素反演

表2为Multiplex®Research测得的叶片荧光参数值与SPAD值的相关系数结果。从表2可以看出，共有8个荧光参数值与叶片SPAD值达到了极显著相关关系，其中 FRF_B（蓝光激发的红外荧光）、RF_G（红光激发的红色荧光）、FRF_G（绿光激发的红外荧光）、RF_R（绿光激发的红色荧光）、FRF_R（红光激发的红外荧光）、FER_RG（红光激发的红外荧光）与SPAD值呈负相关，SFR_G（绿光激发的简单荧光比率）、SFR_R（红光激发的简单荧光比率）与SPAD值呈正相关。

图3　纽荷尔脐橙叶片高光谱反射率与叶绿素含量的相关系数图Fig. 3　The correlation coefficient of reflectance and chlorophyll content of Newhall navel orange leaves

表2　荧光特征参数与纽荷尔脐橙叶片SPAD的相关性Table 2　The correlation of characteristic fluorescence parameters and SPAD value of Newhall Navel Orange leaves

Multiplex®Research测得的SFR参数主要用来衡量叶绿素含量，采用与叶绿素含量相关性较高的SFR-G荧光值建立PLS模型，所得结果并不理想，其MRE=16.21%、RPD=0.995、rc=0.683、rp=0.594，不能较好估测纽荷尔脐橙叶片叶绿素的含量。将筛选得到的8个荧光特征参数全部作为自变量建立叶绿素含量SPAD值多元线性回归PLS反演模型，并进行模型精度检验，其 RPD=4.807、MRE=2.37%、rc=0.767、RMSE-CV=2.731、rp=0.930、RMSE-P=1.986，无论校正集还是预测集的相关系数均较高、预测集MRE较低、RPD较大，故利用特征荧光参数建立模型可以对叶绿素含量SPAD值进行较好的预测，且模型精度较高。

2.4　基于R、G、B等图像色彩参数的纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量反演

一般图像处理中常用RGB或HIS两种彩色系统，具有对光源变化不敏感、不同颜色易于区分的特点[27]。故本研究对所有试验样本利用Photoshop CS6图像分析处理，提取纽荷尔脐橙叶片扫描图像的RGB，R、G、B均值，并对R、G、B进行各种形式的变换得到25个色彩参数，以此作为图像的颜色特征信息。同时分析叶片各色彩参数值与叶绿素值 SPAD值的相关性，结果如表3所示。从表3可以看出，本试验所选用的25种颜色特征信息都与叶片SPAD值呈显著或极显著相关，相关系数r均大于0.325（n=57，r0.01=0.325）。其中 b、R/G、B/G、B/R、B/(G+R)、B-R、(B-R)/(B+R)、r-g参数与SPAD值呈负相关，其余参数与SPAD值呈正相关，且对颜色参数R、G、B值进行归一化等变换后获得的大部分参数与SPAD值的相关性均有所提高。

利用所有特征参数建立PLS多元回归模型，精度较优于其他模型，MRE仅为1.73%，可较好的预测叶片叶绿素含量。为减少模型输入量，提高运算速度，选用与SPAD值相关系数在0.7以上的16个参数分别建立一元与多元回归模型，结果如表4所示。利用特征参数分别建立叶片叶绿素含量反演模型，MRE均低于5%、RPD均在2以上，表明所建模型均能较好地预测纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量，且综合多个评价指标可以得出以G-B参数建立的模型最优。

表3　数字图像获取的图像色彩参数与纽荷尔脐橙叶片SPAD值的相关系数Table 3　The correlation of color parameters and SPAD of Newhall Navel Orange leaves

表4　纽荷尔脐橙叶片SPAD值与图像色彩参数回归模型及精度Table 4　The estimation models and accuracy for SPAD of Newhall Navel Orange leaves based on color characteristic

3　讨论

本试验所采用的3种不同的传感器FieldSpec4地物光谱仪、数字图像技术、Multiplex®Research荧光多酚含量测定仪检测纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量，结果表明，三者预测精度较高，平均相对误差均在5%以下；其中，利用FieldSpec4地物光谱仪采集叶片光谱反射率，经预处理后构建模型进行叶片叶绿素含量预测，结果表明，光谱预处理对模型预测效果有一定的影响，且并非所有预处理都可以提高模型精度。其中预测叶片叶绿素含量最优的光谱预处理方法为“FD”，并筛选得到3个特征波段，他们与叶片叶绿素含量呈极显著相关。这与王锦坚等[28]、丁永军等[29]利用红边（680—750 nm）、绿峰（550 nm左右）特征研究柑橘叶片叶绿素含量的结果一致。利用Multiplex®Research特征荧光参数构建的叶片叶绿素含量预测模型，主要利用荧光原理测定叶片叶绿素含量，其模型精度较高。基于数字图像分析技术的纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量检测结果与易时来[9]、柴阿丽[27]、王娟[30]等的结果基本一致，利用归一化色度坐标与数学变换后的多种参数建立的模型均可较好地预测叶片叶绿素含量，但所筛选的具体特征参数略有差异。该差异是否与纽荷尔脐橙叶片具有蜡质层结构、叶片成熟度或者图像信息采集方式有关，还有待进一步研究。

利用以上3种传感器及其检测技术均可较好的预测纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量，但各有利弊。FieldSpec4地物光谱仪光谱信息丰富，可用于多种成分检测，但受光照影响较大，在两次白板校正之间光照的微弱变化可能会导致结果的差异，得到的光谱信息也需要经过预处理等变换才能较好的反演叶绿素含量，操作不太轻便；但采用室内测定单叶片光谱反射率有较大优势，通过内置光源叶片夹装置夹持叶片进行测定，测量面为直径21 mm圆面，测定环境密封相对稳定，且仪器内置光闸及DriftLockTM自动漂移修正，可以通过RS3软件监视探测器暗电流漂移，连续地调整暗电流噪音补偿，有效消除波长大于1 000 nm范围内由于探测器暗电流造成的与热漂移相关的巨大误差，适用于叶绿素含量状况和其他物质含量状况的综合比较，同时获得叶绿素与矿物元素含量指导营养诊断。相比于其他两种方法，该方法控制环境稳定，预测模型精度高。本研究所涉及的数字图像技术，扫描仪作为核心部件，采用 CCD光电耦合器作为图像传感器，自带冷阴极荧光灯作为照明设备，发光均匀稳定结构强度高；与普通数码相机等传感器相比，其便捷性较差，但其成本低、测定环境相对稳定、操作简单，适宜于室内大批量叶片叶绿素含量的测定。Multiplex®Research荧光多酚含量测定仪便携快速，内置3级功率光源，除了雨天均可室外采集叶绿素信息，极大程度地避免光强变化导致的误差，除叶绿素外也可反映出叶片氮素营养和花青素、多酚类等物质含量；便携程度优于地物光谱仪、数字图像技术等设备，但测量指标相对专一、预测精度也不及前二者。针对3种传感器建立纽荷尔脐橙叶片叶绿素含量与不同传感器测量值对应检索表，达到真正快速便捷、市场化应用，是我们今后的重要研究目标。

4　结论

采用 FieldSpec4地物光谱仪获取叶片光谱反射率，以532 nm、586 nm、705 nm波段光谱信息经FD预处理法后建立的叶片叶绿素定量反演模型的预测精度最优，MRE仅为1.80%，RPD=3.801。

数字图像采集的图像色彩参数所建模型预测精度在本试验中排名第二，以所有特征参数建立的PLS多元线性回归模型以及G-B参数建立的一元二次回归模型（Y=0.0269x2-1.4702x+87.782）预测精度最优，MRE分别为1.98%，RPD=3.946。

Multiplex®Research测得的叶片荧光参数所建立的模型精度相对较差，但以8个特征荧光参数值全部作为自变量所建立的PLS模型最优，MRE为2.37%，RPD=4.807。

本试验所提到的3种传感器均可应用于纽荷尔脐脐橙叶片叶绿素含量的估测，具体可根据检测成本以及便捷性等需求选择适用的仪器。

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