miRNAs调控成肌分化及其在肌肉减少症中的分子机制

余博飞(综述), 李贞鹏, 徐 杰(审校)

肌肉减少症最早于1989年由Rosenberg提出，用来描述随着年龄增加而出现的骨骼肌质量减少和肌力减退，并伴随机体功能下降进而导致跌倒、残疾等不良事件为特征的疾病[1]。随着我国人口老龄化加剧，肌肉减少症变得日益常见，它不仅容易导致老年群体摔跤、骨折和机体失能，同时还显著增加罹患糖尿病、骨关节炎、骨质疏松及动脉粥样硬化等疾病的风险，影响老年人生活质量，给家庭、社会及医疗服务系统带来沉重的经济负担[2]。microRNAs(miRNAs)是一大类广泛存在于真核细胞中的参与基因调控的小分子RNA，在肌肉生长发育及损伤后的再生修复过程中，miRNAs的异常表达与之关系尤为密切。本研究将对 miRNAs 参与调控骨骼肌分化及其在肌肉减少症防治方面的作用机制做一综述，旨在为确立miRNAs作为肌肉减少症治疗的潜在靶点提供新思路和新方向。

1 miRNA的概述和骨骼肌的发育分化

miRNA是长度约为20～25 bp的高度保守的小分子RNA，广泛存在于真核生物中[3]。通过与其靶信使RNA(messenger RNA, mRNA)的3′-非翻译区(3′-untranslated region，3′-UTR)特异性结合，抑制靶mRNA的翻译或者使其降解，从而实现在转录后水平负向调控基因表达。近年来，大量的研究表明，miRNAs对骨骼肌生理发挥重要作用，许多miRNAs被证实参与调控骨骼肌生长发育和再生修复过程，并且在一些骨骼肌疾病中也检测到了异常表达的miRNAs[4]。通常把在骨骼肌或者心肌组织中高富集表达的miRNAs称为肌肉组织特异性miRNA(myomiRNA)，经典的myomiRNA包括miRNA-1，miRNA-133及miRNA-206[5]。

骨骼肌的形成是个十分复杂的过程，包括骨骼肌的干细胞即卫星细胞激活后形成成肌细胞，成肌细胞增殖到一定数量后退出细胞周期、分化形成多核肌管，多核肌管进一步成熟，进而形成具有特定功能的肌纤维。这一复杂过程的进行受到许多成肌分化因子的精密调控，目前公认的有成肌调节因子家族，包括生肌因子(myogenic factor 5,myf5)、成肌分化因子(myogenic differentiation, MyoD)、成肌调控因子4(myogenic regulatory factor 4,mrf4)和肌细胞生成素(myogenin, MyoG)，其中MyoD是成肌程序启动的决定因子。另一类参与成肌分化的调控因子是Pax转录因子家族，主要包括Pax3和Pax7，这二者主要负向调控MyoD的表达，这对于维持骨骼肌干细胞的状态至关重要。一旦启动成肌决定，卫星细胞激活，Pax3和Pax7表达立即减少，成肌相关的转录因子表达增加。

2 miRNAs参与成肌分化的调控作用

2.1肌肉特异性miRNAs在骨骼肌分化中的调控作用 前已述及，经典的MyomiRNA有miR-1,miR-206,miR-133，其中miR-1和miR-133在心肌和骨骼肌中均有表达，而miR-206只特异性表达在骨骼肌中。miR-1通过抑制组蛋白去乙酰化酶 4(histone deacetylase，HDAC4)促进成肌细胞分化，HDAC4是成肌相关基因的转录抑制物，通过抑制肌细胞增强因子2C(myocyte-specific enhancer factor 2C,MEF2C)来发挥作用[6-7]，此外，miRNA-1抑制HDAC4表达后会产生卵泡抑素，后者能加速肌管融合从而促进肌肉生长[8]。Kukreti等还发现，miRNA-1参与高剂量的地塞米松诱导的骨骼肌萎缩[9]，其机制是miRNA-1下调具有保护性的热休克蛋白70的表达，同时增强FOXO3，MuRF-1及Atrogin-1这三个萎缩信号。miR-133a 一方面可以通过抑制血清反应因子促进肌细胞增殖[7]，另一方面又可以参与骨骼肌生长发育的重要通路——IGF信号通路。研究表明，miRNA-133可以靶向胰岛素生长因子1受体(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)，在C2C12细胞中过表达miR-133，IGF-1R的表达被显著抑制[10]，而 MyoG的表达明显升高。此外，最近一项在C2C12成肌细胞系的实验表明，miRNA-133a还可以抑制Foxl2的表达促进成肌细胞分化[11]，但其如何通过抑制Foxl2表达影响成肌分化仍有待进一步研究。DNA结合受体抑制因子( inhibitor of DNA binding，Id)是成肌转录因子MyoD的抑制因子，早期已有研究表明，miRNA-206通过直接下调Id表达进而促进成肌分化[12]，此外还可与miRNA-486 发挥协调作用，通过与Pax7的 3'-UTR结合，抑制DNA结合受体抑制因子2(Id2)的蛋白表达，进而促进成肌分化[13]。最近的研究表明，MyoD促进成肌分化是通过诱导产生miRNA-206，之后miRNA-206靶向抑制Twist-1的表达来促进成肌分化[14]。

借助于基因芯片技术，近年来又发现了几个在肌肉组织中表达丰富的myomiRNA， miRNA-208和miRNA-499通过肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MHC)亚型参与调节肌纤维类型，肌纤维可分为Ⅰ型(慢)和Ⅱ型(快)肌纤维，其中Ⅱ型纤维又进一步分为Ⅱa、Ⅱb和Ⅱx，其主要差异是MHC亚型组成的不同。miR-208b和 miR-499可激活慢肌特异基因并抑制快肌基因表达来调控肌纤维类型的转换。实验结果表明，过表达 miR-499引起比目鱼肌中快肌完全转化为慢肌。相反，联合敲除小鼠 miR-499和 miR-208b则会导致比目鱼肌慢肌纤维的显著丢失[15]。

2.2肌肉非特异性miRNAs在骨骼肌分化中的调控作用 近几年，一些肌肉非特异性miRNAs被相继发现在成肌分化过程中参与调控，有些通过作用于成肌相关的转录因子，如miR-186通过靶向MyoG，起到抑制肌肉终末分化的作用[16]。MyoD是成肌过程启动的决定因子，高水平的MyoD能诱导myomiRNA表达。有研究发现，miRNA-221/222的过表达或者敲除可分别导致MyoD蛋白表达下调或者上调，进而引发其下游myomiRNA表达的抑制或者增强[17]。Togliatto等在构建下肢骨骼肌缺血损伤后再生的小鼠模型中发现，去乙酰化的胃饥饿素能诱导产生超氧化物歧化酶-2(SOD-2)来抵抗活性氧物质造成的细胞损伤[18]，巧合的是，此作用也要依赖于SOD-2诱导表达的miRNA221/222。Dai等发现了另一个参与调节MyoD活性的miRNA-128[19]。荧光素酶报告结果显示，其靶向mRNA是SP1，而SP1是MyoD的激活物和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(CDKN1A，P21)的抑制物，后者可抑制细胞增殖，是一个肿瘤抑制基因。实验表明，高表达的miRNA-128通过结合SP1抑制卫星细胞的增殖与分化。有趣的是，抑制miRNA-128表达后，卫星细胞分化增强但增殖依然被抑制，这可能是由于SP1水平升高及MyoD表达增强后使细胞加速退出细胞周期所致。不仅如此，该研究小组还发现了miRNA-143通过作用于IGF信号通路上的一个重要信号分子——IGFBP5，从而增强IGF信号通路起到促进骨骼肌生长发育的作用[20]。

miRNAs不仅可以对基因进行转录后调控，还能参与调节基因的时空表达模式。选择性剪接是基因的一种表现形式，通过将同一基因中的外显子以不同的组合方式来实现，使一个基因的表达具有时空性。RNA结合蛋白Rbm24是肌肉特异性选择性剪接的主要调控者，有学者发现，miRNA-222可以靶向Rbm24从而在选择性剪接水平调控成肌分化[21]。肌形成过程除了需要特定转录因子外，科学家们也发现了一些与成肌分化相关的特定功能蛋白。最近，Luo等在小鼠肌肉里找到一种被称为成肌蛋白的跨膜蛋白，该蛋白对肌管融合至关重要，通过RNA干扰技术敲除成肌蛋白基因后[22]，成肌细胞的融合被显著抑制。他们还发现，在体外miRNA-140-3p能与成肌蛋白基因的3′-UTR结合从而抑制成肌细胞融合。

miRNA对信号通路的调控也能影响成肌分化过程。TGF-β-Smads是一条负向调控骨骼肌生长和再生的重要信号通路，目前已发现了多种能调节Smads蛋白水平的miRNAs。MiRNA-26a通过抑制Smad-1和Smad-4的表达促进成肌分化[23]，而miR-675-3p是抑制Smad1和 Smad5[24]，miRNA-146b的靶向mRNA包括Smad4，Notch1及Hmga2[25]，miRNA-431是最近才被确认的能够通过靶向 Smad4促进成肌分化[26]。肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)属于TGF-β家族，又被称为生长分化因子8，通过抑制IGF-Akt及Wnt信号途径等来强力抑制肌细胞增殖分化。近来已证实，miRNA-27a/b通过靶向MSTN促进成肌分化[27]。Wnt信号通路在骨骼肌生长发育中的作用很早以前就得到确认。有研究发现，miRNA-199-5a通过调节Wnt信号通路的蛋白水平，共同调节成肌细胞增殖和分化[28]。因此，在营养不良肌肉中过表达 miRNA-199-5a会阻碍信号通路，进而阻碍成肌分化与再生。与此相反，miRNA-145-5P发挥正向调节的作用，通过结合Wnt信号通路上的一些特殊基因，包括Wnt5a，LRP5，Axin2及β-catenin[29]。

3 miRNAs与肌肉减少症

肌肉减少症是随着年龄增加而进展的肌肉代谢失衡性疾病，表现为骨骼肌蛋白质合成减少和分解增加，除了骨骼肌蛋白代谢紊乱外，近年来对骨骼肌干细胞的相关研究报道也越来越多，研究发现在机体衰老过程中骨骼肌卫星细胞存在明显的功能障碍，表现为自我更新能力丧失、再生能力减退等[30-32]，这些都与骨骼肌萎缩的发生密切相关。

借助于全基因组miRNA分析技术，Kim等在成年小鼠与衰老小鼠腓肠肌组织的对比表达分析中，检测到34个差异表达的miRNAs[33]，表达上调的miRNAs中miRNA-206，miRNA-34a，miRNA-146，miRNA-155和表达下调中的miRNA-143，miRNA-148在既往研究中均有报道。另外，他们还发现，这些miRNAs中有8个是以成簇的形式存在于小鼠12号染色体上的Dlk1-Dio3印记区，而此印记区在小鼠骨骼肌发育过程中具有调节作用。Shin等发现，膜结合型的Dlk1能促进C2C12成肌细胞的肌向分化[34]，而水溶性的Dlk1作用正好相反。此外，通过RNA测序，Mercken等在猕猴身上的研究也发现了差异表达的miRNA[35]，其中miRNA-451，miRNA-144，miRNA-18a及miRNA-15a等表达上调，miRNA-181a和miRNA-181b等表达下调，并且在热量限制(caloric restriction，CR)的实验组与正常能量摄入的对照组中，实验组里上述4个上调的miRNA表达均减少，而miRNA-181b和miRNA-489表达增加，表明热量限制能够逆转衰老骨骼肌中某些特定的miRNA表达水平，并且CR饮食组较正常饮食组具有更高的肌肉量。Hu等在啮齿类动物的研究里也取得了可喜的进展，发现在衰老的小鼠和大鼠里，miRNA-29呈显著的高表达，miRNA-29通过结合P85α，IGF-1及B-myb的3′-UTR来抑制其表达；同时，上调细胞周期抑制物P53，P16及pRB的表达，实验结果显示高表达的miRNA-29使骨骼肌干细胞呈现衰老表型，表现为细胞增殖受到抑制，进而出现肌肉的萎缩[36]。此外还明确了Wnt3a能刺激miRNA-29表达上调。有趣的是，miRNA-29还同时具有促进成肌细胞肌向分化的能力[37]，出现这个矛盾现象可能是由于增殖受限导致成肌前体细胞数量不足，故出现肌肉量减少和肌肉萎缩。

抗阻训练是减缓肌肉量丢失，干预肌肉减少症进展的重要措施，这是由于抗阻训练可增强骨骼肌蛋白质合成有关的信号通路的表达，而IGF-1作为骨骼肌主要的调节因子，其主导的Akt-mTOR信号通路是骨骼肌蛋白质合成的主要调控通路[38-39]。Zacharewicz等在人体上的研究表明，衰老的个体对一些如抗阻训练的合成刺激反应性减弱，同时Akt-mTOR信号通路活性下降，蛋白质合成代谢减弱，进而导致骨骼肌萎缩[40]。在肌肉活检组织检测到的754个miRNA中，有9个与Akt-mTOR信号通路高度相关，5个已被证实通过结合Akt-mTOR通路上一些信号分子的3′-UTR发挥作用，其中多数属于miRNA-99/100家族，如miR-99a-5p, miR-99b-5p和miR-100-5p等，表明这些miRNA可作为肌肉减少症治疗的潜在靶点。

4 展望

miRNAs作为一类重要的基因表达调控者，已被证实参与多种生理和病理过程，其作为成肌分化调节网络的重要组成部分也是在最近才逐渐得到确认。尽管miRNAs的研究手段在不断进步，尤其随着新一代测序技术的应用，为揭示更多miRNAs的作用机制提供重要的技术支撑，但总体研究仍处于起步阶段，miRNAs在肌肉减少症等增龄性肌肉疾病的临床应用价值还有待开发。相信随着对miRNAs作用机制的进一步认识，定能为肌肉疾病的诊断和治疗带来新的契机。