细胞外囊泡与红细胞生成及相关制品的研究进展

孙士鹏 安成 刘贵建 吴志奎

细胞分泌的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）包括外泌体（exosomes）、外体（ectosomes）、微泡（microvesicles）、微粒（microparticles）、凋亡小体（apoptotic bodies）等成分［1］。这些细胞分泌的EVs存在很大的异质性，目前依据透射电镜、免疫电镜和其他生物化学的方法，可把EVs主要分为外泌体和微泡2大类［2］。外泌体是多种活细胞晚期内体分泌的30～100 nm的小囊泡体，在蔗糖密度梯度溶液中密度范围为1.13～1.19 g/mL［3］。EVs的主要功能是作为蛋白质、脂质和RNAs的递送载体，介导体内不同细胞类型之间的细胞间通讯，从而影响正常和病理状态。最初外泌体的发现源于红细胞成熟，外泌体与红系分化关系极为密切。EVs及其携带的miRNA等分子的功能研究主要集中在红细胞发育分化成熟的调控以及临床用红细胞制品领域，本文就红细胞生成和红细胞制品的相关EVs研究进展进行论述，以期为红细胞疾病的相关机制研究以及疾病治疗提供新的思路。

1 细胞外囊泡的定义及其发现

1.1 细胞外囊泡的定义及生成

EVs是在多囊泡胞内体（multivesicular endosome，MVE）成熟过程中，由内体膜通过内出芽形成的管腔内囊泡，随后通过MVE与细胞膜融合的方式释放到细胞外［4］。EVs广泛存在于精液、血液、尿液、唾液、母乳、羊水、腹水液和脑脊液等体液中［5］。迄今为止，文献报道包括树突状细胞、肥大细胞、T细胞、B细胞、表皮细胞、间充质干细胞、神经元细胞和许多肿瘤细胞等在内的几乎所有的细胞都能分泌外泌体［1］。EVs形成和排出细胞的过程中主要依靠4种内体分选复合物（ESCRT0，I，II，III）把细胞内含物、跨膜蛋白以及膜周边蛋白质掺入到外泌体中［6］。作为EVs的主要存在形式，外泌体也可以以ESCRT非依赖的方式形成，四跨膜蛋白CD63、CD81、CD9也直接参与各种“货物”向外泌体的分选［7］。

1.2 细胞外囊泡的发现源于红细胞成熟

红细胞是血液中数量最多的一种血细胞，主要功能是在脊椎动物体内运送氧气的最主要的媒介，同时还具有免疫功能。EVs发现源于红细胞成熟，随着EVs研究的火热化，其在红系分化中的作用也被逐步揭示出来。20世纪80年代研究人员陆续发现大鼠网织红细胞、绵羊红细胞等分泌小囊泡，并定义了外泌体，即起源于网织红细胞成熟时细胞外部膜囊泡。外泌体曾一度被视为是红细胞成熟时去除的胞内废弃物。直到20世纪末才发现B细胞分泌的外泌体能够携带并运输功能性的抗原提呈复合物，提出外泌体可能是免疫系统的细胞之间的通信运载体［8-9］。可见外泌体与红细胞的研究有很深的渊源，科学界对其功能认知也经历了否定之否定的过程。

2 细胞外囊泡的功能研究进展

几乎所有细胞都能分泌EVs［1］，在多种体液中存在的EVs通过将核酸和蛋白质转移到靶细胞和组织中，在细胞-细胞通讯中起关键作用。外泌体携带多种蛋白质、脂质和RNAs，目前外泌体结构和功能数据库ExoCarta（http：//exocarta.org/）数据库中已经鉴定出外泌体含有9 769种蛋白、3 408种mRNA和2 838种miRNA。不同的细胞来源EVs，通常携带有独特的货物如miRNA或整合素，因而可作为相关疾病的分子标记物。多用于肿瘤诊断以确定特异性癌症亚型，例如胶质母细胞瘤患者血清外泌体包含特征性EGFRvⅢ突变体基因mRNA和miRNA可能作为疾病诊断的标志物［10］。EVs尤其是外泌体介导体内不同细胞类型如肿瘤细胞、成纤维细胞、内皮细胞、白细胞等细胞之间的通讯，因而在炎症反应、肿瘤血管生成、组织炎症、免疫重建、肿瘤免疫治疗等方面发挥重要作用［11-12］。例如EVs能在未来转移部位与肿瘤微环境中的基质细胞相互作用，以促进扩散的肿瘤细胞的存活和生长，并增加肿瘤细胞侵袭性［10］。

3 红细胞中的细胞外囊泡

3.1 红细胞成熟过程中的细胞外囊泡研究

红系分化从造血干细胞开始，逐渐失去分化潜能，经历早期红系集落生成细胞（burst-forming unit-erythroid，BFU-E）和红细胞系集落形成单位（colony-forming unit-erythroid，CFU-E）最终脱核和变形成为有功能的成熟红细胞。造血前体细胞主要存在于骨髓中，少量释放到外周血中。成熟红细胞中含有血红蛋白但是没有细胞核和线粒体，因而成熟红细胞内没有DNA仅有少量残存的RNA。HBB是血红蛋白β亚基的编码基因，HBBmRNA不会在成熟红细胞内大量存在。Jun等［13］在外周血外泌体中可以检测大量HBBmRNA，此结果说明含有大量HBBmRNA的外泌体应该是来自骨髓红系前体细胞释放到外周血中，而不可能来源于外周血成熟红细胞。这些含有大量HBBmRNA的外泌体是骨髓前体红细胞代谢的废物，还是主动释放到外周血中由红细胞等摄取而发挥特定的功能尚未被揭示。

成熟红细胞和红系前体细胞膜蛋白存在差异，这些差异蛋白的表达也与外泌体关系密切。红细胞在成熟过程中有一些不再需要的膜蛋白质可以通过外泌体排除途径释放出红细胞，致使成熟红细胞表面此蛋白减少或缺失。例如：大部分成熟红细胞的转铁蛋白受体（Transferrinreceptor，TfR）作为管腔内囊泡的货物通过MVE和随后的外泌体释放出来，其机制是基于细胞膜脂处理系统来调控膜蛋白的分选［14］。此外乙酰胆碱酯酶和整合素α4β1也可以通过外泌体排除途径释放出红细胞，从而使细胞表面这些蛋白质减少或消失［15］。网织红细胞上整合素α4β1的存在会导致某些疾病的血液循环并发症，因而通过外泌体清除红细胞上的整合素α4β1非常重要。整合素α 4β1在造血祖细胞上表达，随着红系分化成熟细胞含量逐渐下调。外泌体上整合素α4β1能够与内皮细胞上的血管细胞粘附分子1（VACM-1）结合，可能参与了其他重要的功能。相反，部分膜蛋白则只存在于成熟红细胞膜而外泌体膜上没有表达或含量很低。例如：B-spectrin蛋白在网织红细胞成熟时不会从细胞膜上丢失，在网织红细胞外泌体上检测不到B-spectrin蛋白［16］。血型糖蛋白A（GPA）在红系来源的外泌体上的分布也远低于红细胞。还有一些蛋白在成熟红细胞和红细胞来源的外泌体上均有表达。ABCB6是ATP转运蛋白家族的成员之一，被认为是负责线粒体摄取卟啉的蛋白。Katalin等人［17］发现ABCB6既存在于成熟红细胞上，在红细胞成熟的最后步骤从网织红细胞释放的外泌体上也有表达，但是其功能还有待揭示。相比红细胞的质膜来说，红细胞来源的外泌体膜中二酰基甘油（DAG）、胆固醇、补体受体1（CR1，CD35）和GPI锚定蛋白如CD55、CD59以及乙酰胆碱酯酶相对含量较高［18］。这些红细胞来源的外泌体是否还发挥着重要的生理功能？还是作为代谢废物经过肾脏通过尿液排出体外？近期的一项针对镰形红细胞贫血的研究提示这些外泌体可能仍是具有功能性作用的。研究发现镰形红细胞贫血患儿血浆外泌体主要来源于红细胞，其含量远高于健康对照组［19］。镰形红细胞贫血患者的EVs能显著增加单核细胞与内皮细胞的粘附功能、促进内皮细胞P-选择素高表达，而且病情严重的镰形红细胞贫血患儿的EVs增加单核细胞粘附功能最强。红细胞来源外泌体的功能还需要进一步的关注和研究。

当前对EVs及其装载物的功能研究主要集中在miRNA领域，红细胞相关EVs的miRNA研究也取得了一定的进展。虽然成熟红细胞内仅残留部分RNA，但是这些RNA包含了多种miRNA。Simonas等［20］使用磁珠分选系统从人外周血分离获得CD235a+的红细胞，提取RNA经过Illumina HiSeq 2500测序鉴定出271种已知miRNA，而且每个样本大多数miRNA的平均reads读数＞1 000 reads。这说明成熟红细胞分泌的外泌体中应该装载有miRNA，但是当前红细胞相关外泌体内非编码RNA功能研究较少，功能还有待揭示。miR-486是氧化应激的急相反应miRNA，在红系分化过程中发挥非常重要的作用［21］，研究发现外泌体来源的miR-486可以靶向人红系白血病TF-1细胞内SIRT1蛋白促进细胞向红系分化、增殖［22］。外泌体来源的miR-486等理论上能够直接参与红系分化和氧化应激反应，在红细胞生成障碍、贫血等生物学过程中发挥的作用还需要进一步研究。

3.2 红细胞储存过程中细胞外囊泡的研究

当前红细胞相关EVs的研究较多的集中在红细胞制品领域。在血液储存过程中，红细胞经历新陈代谢和生化反应都会显著影响红细胞膜的完整性、变形性和携氧能力。由于输血成分的变化可能会导致组织缺氧或者炎症反应，进而降低输血后受者存活率。虽然为了确保血液制品的安全性，在浓缩红细胞制品（red blood cell concentrate，RCC）的加工和储存中应用了监管标准，但许多产品质量特性受到制造方法和低温保存的影响。目前，存储持续时间对血液制品质量和输血结果的作用一直是研究的焦点。血液中的EVs是输血后炎症和凝血的潜在影响因素，在RCC的存储过程中EV的异质性可以作为红细胞损伤的指示器［23］。研究者们［23］通过使用流式细胞术分析和可调电阻脉冲传感设备进行定量研究，在RCC产品中观察到EV亚群和浓度以及细胞质量参数的差异显著，随着低温贮存期延长，RCC的EVs的数量增加。

研究发现随着红细胞EVs的释放，造成存储红细胞膜渐进性和显著的补体调节因子（如CR1、CD55和CD59）的显著缺失，这些EVs具有潜在的输血相关免疫调节作用［24］。除了逐渐失去补体调节作用，储存的红细胞CR1功能损失导致储存的红细胞结合和清除补体调理的能力稳步下降。虽然静息的中性粒细胞比红细胞表面的CR1表达量高出200～300倍，但是红细胞CR1免疫复合物的亲和力较中性粒细胞（PMN）CR1强，所以调理颗粒优先结合到红细胞CR1上［25］。临床上常用的红细胞制品的储存时间在很大程度上影响了其释放的外泌体等胞外囊泡的大小和浓度［26］。因而红细胞制品相关EVs的研究对输血相关免疫调节作用极为重要。因而，输血相关EVs的研究报道目前还很少。

4 小结及展望

健康个体持续每秒合成约200万的红细胞替代衰老的红细胞。这个新旧更替过程必须被严格控制以保证红细胞数量能够维持在一个很小的生理范围内。EVs是多种活细胞晚期内体分泌的小囊泡体，主要功能是作为蛋白质、脂质和核酸等分子的运送载体。相对EVs在肿瘤和炎症等领域取得的成果来说，红系分化和红细胞制品相关的外泌体研究虽然有所进展，但是仍然进展缓慢。当前EVs的研究主要受到分离纯度和费用的限制，降低分离纯度成本并提高纯度是亟待解决的主要问题。在分离纯度方面，差速离心法结合超高速离心法仍是金标准的方法，可以获得人外周血EVs包括外泌体、外体、微泡、微粒、凋亡小体等成分，如何对这些异质性的EVs进行研究？是通过物理化学的方法对不同大小的EVs进行分门别类的研究，还是对同种细胞来源的EVs进行研究？科技进步需要更加细致和精密的研究，在当前科技水平条件下，笔者倾向于后者。对于某类细胞来源的EVs（例如红细胞来源的EVs）的分离纯化需要用到特定细胞表面标记分子的相应抗体标记的磁珠，用于研究或者诊断的费用则大为增加，我们期待技术的革新和进步。

EVs及其运送的小分子功能涉及到表观遗传修饰、相关转录因子和基因的表达调控等，在红系细胞的分化和发育及成熟过程中起到关键作用。在红系细胞的分化和发育及成熟过程中会释放大量的EVs到外周血当中，但是相关的EVs的功能研究依然很少。由于遗传、营养以及缺铁、疟疾、血吸虫病、慢性肾脏病等病因导致红细胞生成、代谢或者细胞降解异常就会导致患者贫血。当前贫血是一种全球性的健康问题，全球约1/3的人群贫血［26］。可见红细胞生成以及贫血机制的研究是全球亟待解决的难题。给贫血患者输注红细胞制品是贫血治疗的一种常用的临床方法，红细胞制品相关EVs在输血相关免疫调节中的作用也逐步被揭示出来，例如镰形红细胞贫血患者的研究从一个侧面揭示了红细胞相关EVs参与了血管内皮屏障、单核细胞与内皮细胞的粘附功能。我们认为可以从以下几点对红细胞相关EVs进行深入研究将会为贫血相关机制的揭示以及贫血治疗带来突破性的技术和思路：①红系造血相关EVs的机制研究；②炎症性EVs的机制研究；③血液制品EVs检测技术；④血液制品EVs质量及其对输血者的造血和免疫调节等。