牛的基因编辑技术研究进展

汤波 孙照霖 戴蕴平

（中国农业大学生物学院，北京 100193）

基因编辑技术是对基因组进行定点修饰的一种新兴生物技术，由于可以对几乎任何生物的基因组进行精确修饰，就像文字编辑软件对论文进行字句的编辑一样，因此被称为基因编辑技术。目前基因编辑技术主要包括锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFN）技术、转录激活因子样效应物核酸 酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）技术以及最新的成簇规律间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9技术。近年来，基因编辑技术就像“风暴”一样席卷整个生命科学领域，在短短几年时间内，这项技术已用于改造几乎所有常见的微生物、植物和动物，甚至是人类细胞和胚胎，展现出令人惊喜的应用前景。由于牛的基因编辑难度大、制作成本高，牛的基因编辑技术发展稍晚于其他物种，但是基因编辑技术已开始在抗病、改善奶品质、提高瘦肉率、去取牛角等牛新品种培育领域发挥越来越重要的作用。

1 牛的基因编辑技术发展历史

1987年，来自美国犹他大学的Mario Capecchi团队及来自北卡罗来纳大学的Oliver Smithies团队分别建立了基于小鼠胚胎干细胞的基因打靶技术。2007年，上述两人与胚胎干细胞的发明人、英国卡迪夫大学的Martin Evans教授一起分享了诺贝尔生理或医学奖。

然而之后的十多年里，由于牛、猪、羊等大家畜的胚胎干细胞分离工作进展缓慢，基因打靶技术一直局限于小鼠身上。随着1997年体细胞克隆绵羊“多莉”的诞生，大家畜基因打靶才陆续获得突破。继第一例基因打靶羊和基因打靶猪于2000年和2002年相继问世之后，2004年美国Hematech公司首次利用“连续基因打靶技术”成功培育出了第一例多基因敲除牛［1-4］。

由于大动物体细胞的基因打靶效率极低，只有少数几个实验室利用Cre/loxP系统和体细胞克隆技术相结合，成功培育出了基因打靶牛［5-9］。尽管很多实验室对基因打靶技术不断进行条件优化和改进，但是哺乳动物细胞的基因打靶效率并没有显著提高，直到ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因编辑技术的出现，迎来了大家畜基因编辑时代的到来［10］。

1.1 锌指核酸酶基因编辑技术

锌指核酸酶，又叫锌指蛋白核酸酶，是由锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）和Fok I内切核酸酶共同构成［11］。其中锌指蛋白能够识别和结合特异的DNA序列，Fok I核酸内切酶形成二聚体后能够切割非特异性的DNA序列，对基因从而进行目的基因的修饰，此技术为第一代基因编辑技术。

ZFN 中的ZFP 结构域通常由3-6 个C2H2 类型的锌指重复单位串联而成，其基本骨架大多来自人或小鼠的天然锌指蛋白ZIF268［12］。其中每个锌指可直接特异识别DNA双螺旋中某一条单链上3 个连续的核苷酸；由多个锌指串联形成的ZFP 结构域则可识别更长的靶序列，同时也就增加了DNA 靶向修饰的特异性［13］。当两个锌指核酸酶单体同各自的目标位点特异结合，且这两个位点在 DNA 双链上的距离和方向符合一定要求时，两个 Fok I 切割结构域可形成二聚体的活性形式，在两个结合位点的间隔区（Spacer，通常为 5-7 bp）中发生切割，产生DNA双链断裂（Double Strand Break，DSB）切口；紧接着细胞通过同源重组（Homologous recombination，HR）或非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）等方式修复 DSB，而这两种修复方式中可能会出现人为的引入变化或是自发错误，从而造成基因组 DNA 序列的突变，实现基因打靶这一过程［14］。

2001年，Bibikova等［15］首次报道在非洲爪蟾卵母细胞内利用ZFN成功介导同源重组，引起国际生物领域的广泛关注。很快，ZFN技术被广泛应用于人类细胞和其它动物基因打靶研究。从2011年，中国农业大学的Yu等首次成功培育ZFN介导的基因打靶牛以来，已有多个多课题利用培育出ZFN技术培育出基因敲除牛和基因定点敲入牛［16-19］。

但是，ZFN技术也存在一些明显的缺陷：一是存在脱靶效应，即ZFN除了在特异位点发挥作用，还非特异性地与目标位点以外的DNA序列相互作用，引发非特异位点的同源重组；二是ZFN技术并非适用于任何序列，由于锌指蛋白的结构中只有α-螺旋的6个氨基酸可特异识别三连碱基，不是任意三连碱基组合都有对应ZFNs的模块，所以ZFNs的靶点选择受到限制；三是ZFN设计复杂，成本较高。这些缺陷都限制了ZFN技术的应用范围。

1.2 TALEN基因编辑技术

转录激活因子样效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）。TALEN 跟ZFN技术的作用原理一样，结构也类似，主要由两部分组成，包括识别并结合特异DNA序列的TALE蛋白结构域以及能够切割非特异性DNA序列的Fok I核酸内切酶。

类转录激活因子效应物（TALE）主要由3个部分组成：C-端含有一个核定位信号（Nuclear localization signal，NLS）和转录激活结构域（Activation domain，AD）、N-端一般含有转运结构域（Translocation domain，TD）、而中间是能够和DNA进行特异性结合的结构域。中间的DNA结合结构域是一段特别长的重复氨基酸序列、不同种类的TALE蛋白的中间结构域是由1.5-33.5个TALE单元组成的重复氨基酸序列组成、每个TALE单元由33-35个氨基酸残基组成［20-21］。在一个重复的氨基酸序列中每个重复单元和末尾的半个重复单元均可特异性地识别并结合DNA的一个特定核苷酸位点，将TALEs与核酸酶结合即构建成完整的TALENs。

2010年，Christian和Li等两个课题组［22-23］首先在酵母中证明了TALEN也能像ZFN一样促进双链断裂，引发同源重组。之后不久，很多不同实验室利用TALEN技术实现了不同物种的基因打靶。由于其特异性强、设计方便、成本低，TALEN逐步取代ZFN技术，成为新一代基因编辑技术，美国明尼苏达大学、美国维克森林再生医学研究所、中国西北农林科技大学的研究团队相继利用TALEN基因编辑技术对牛的体细胞、胚胎进行基因编辑，有些课题组最终还培育出了基因编辑牛［24-29］。TALEN可以和ZFN一样对复杂的基因组进行精细的修饰，同时其构建相比ZFN较为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的青睐。2012 年，TALEN 被《科学》（Science）杂志评为十大科学突破之一。

但是，TALENs的运用依然存在一些问题，例如：（1）TALENs载体大，具有有高度的重复序列，因此在设计和载体构建上都相对困难；（2）在目前的报道中，TALENs主要应用于单基因的敲除，而且一对TALENs敲出一个基因，因此多基因敲除很难实现；（3）TALE重复序列在什么长度下最适合用于DNA序列的识别，以及组装成的TALENs是否具有最优的活性仍然不清楚；（4）TALENs脱靶的问题等。

1.3 CRISPR基因编辑技术

2012年，美国加州大学伯克利分校的Jinek等开发出一种全新的基因编辑技术，是第三代基因编辑技术。所不同的是，前两种基因编辑技术的“查找”工具是酶类，设计和制作成本较高，而CRISPR/Cas9技术是用一种成簇的、规律间隔的短回文重复序列的RNA来寻找靶向序列。由于设计和制作RNA比蛋白质简单，不仅构建成本得到大幅减降低，而且可以精确到单个碱基，同时脱靶效应也得到了极大的改善。

最早利用CRISPR/Cas9技术进行牛基因组编辑研究的是韩国忠北国立大学的研究人员。2014年，Heo等［30］将牛的成纤维细胞培养出诱导多能干细胞，然后将CRISPR/Cas9 mRNA注入牛诱导多能干细胞和胚胎，结果显示CRISPR/Cas9系统能有效地进行牛的基因组编辑。而来自韩国另一所大学的Jeong等［31］利用CRISPR/Cas9系统将人成纤维细胞生长因子2基因定点敲入到牛β-酪蛋白基因座位上，以期高效表达重组生长因子。来自阿根廷的Bevacqua等［32］则利用CRISPR/Cas9系统成功敲除了牛体细胞和体外受精胚胎的朊蛋白基因，其中成纤维细胞的基因编辑效率接近50%，而受精卵的只有12.5%。西北农林科技大学的Gao等［33］建立了Cas9切口酶（Cas9n）定点整合外源片段的技术体系，获得9个外源天然抗性相关巨噬细胞蛋白-1（NRAMP1）基因定点敲入的转基因母牛，脱靶效应显著减少，攻毒试验显示，转基因牛对引发结核病的牛分枝杆菌的抗性明显增强。2017年，日本国家农业生物技术研究所的Ikeda等［34］利用CRISPR/Cas9系统在体细胞水平和克隆胚胎水平，成功修复了日本黑牛中一种由单核苷酸替代引起的隐性遗传病——异亮氨酸-tRNA合成酶（IARS）综合征的致病基因。随着各国科学家研究的深入，将会有很多的CRISPR/Cas9基因编辑牛诞生。

2 基因编辑技术在牛育种中的应用

基因编辑技术在动植物育种方面展现出巨大的应用前景，而目前在牛育种方面的应用则包括提高抗病性、改善奶品质、培育高瘦肉性、去取牛角等。

2.1 提高抗病力

疯牛病、结核病、乳房炎等疫病的爆发和流行，不仅给养牛业带来巨大的损失，也给养牛从业人员和消费者的健康带来严重的危害。研究表明，通过基因编辑技术可以提高牛的抗病力，甚至可以根除一些疫病，如疯牛病。

疯牛病是牛朊蛋白结构变异引起成年牛的一种慢性、神经性、致死性人兽共患病。曾造成欧美国家19万多头牛死亡，疫区养牛业几乎遭受毁灭性打击。2007年，Richt等［6］通过连续打靶的方法成功获得了健康存活20个月大的PRNP-/-克隆牛，这些牛在临床解剖、生理发育、组织病理以及免疫和生殖发育方面都很正常，在这些牛的脑组织提取物中检测不到PRNP基因的表达，在体外实验中这些脑组织提取物能够抑制疯牛病致病因子的扩增。2013年，中国农业大学的Wang等［35］利用无启动子打靶载体对牛PRNP基因进行了连续两轮的基因打靶，并获得了一头健康存活的PRNP+/-克隆牛和3个PRNP-/-细胞克隆点。

基因编辑技术在防御其它疫病方面也发挥重要作用，特别是基因定点敲入一些抗病力相关基因。2013年，西北农林科技大学的Liu等［18］利用锌指核酸酶和锌指切口酶技术，将来自细菌的溶葡球菌酶基因定点插入到β酪蛋白基因位点，共获得8头健康存活的溶葡球菌酶基因定点敲入奶牛，其中两头转基因奶牛催乳结果显示，重组溶葡球菌酶在乳汁中含量为5 ng/mL，其活性相当于金黄色葡萄球菌来源的溶葡球菌酶的10%。之后，该实验室继续利用锌指核酸酶技术，将来自细菌的溶葡球菌酶基因和人溶菌酶基因定点插入到β酪蛋白基因位点，共获得5头健康成活的人溶菌酶基因定点敲入奶牛。ELISA检测结果显示，重组人溶菌酶在转基因奶牛乳腺中含量可达23-31 μg/mL，而牛奶中牛源溶菌酶含量仅为 0.05-0.22 μg/mL［19］。2015 年，同一个实验室的Wu等［28］对TALEN中的FokI酶进行了D450A点突变改造，只保留Fok I酶单链酶切功能，利用改造后的TALEN将源自小鼠的SP110基因转入牛的基因组，并培育出13头健康存活6个月以上的转基因奶牛，体内外的结核杆菌攻毒试验显示，该转基因奶牛能有效抵抗结核杆菌的侵袭。

2.2 改善奶品质

牛奶含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物及多种维生素等营养成分，被誉为营养最为全面的食物之一。人乳中含有乳铁蛋白、溶菌酶、α-乳清白蛋白、胆盐激活脂酶和免疫球蛋白等功能活性蛋白，对于增强机体免疫力、抵御外来病原体、促进生长发育和智力发育等发挥着至关重要的作用，但是牛奶中这些功能蛋白含量极为微量，甚至没有；而且牛奶中还含有一些人体难以吸收的蛋白质，如β-乳球蛋白（BLG）和α-酪蛋白等。增加乳蛋白含量，特别是一些功能蛋白，减少甚至是去除牛奶中的过敏成分，一直是奶牛育种的重要研究方向，但是让牛奶中不含过敏成分，在不添加水解酶的情况下，目前只有基因编辑技术可做到。

2011年，中国农业大学的Yu等［16］首次利用ZFN技术成功培育出β-乳球蛋白基因敲除的奶牛，出生8头克隆牛，其中有1头健康存活，经检测这些克隆牛均为β-乳球蛋白基因敲除奶牛，其中健康存活的克隆奶牛β-乳球蛋白两个等位基因分别发生9 bp和15 bp的缺失，这也是国际上首例ZFN介导的基因打靶牛。锌指核酸酶介导β-乳球蛋白基因敲除效率达20%以上，双等位基因敲除效率也达6%以上，显示ZFN基因编辑技术的效率远高于传统的基因打靶技术。该课题组还通过转基因技术培育出高效表达乳铁蛋白、α-乳清白蛋白、溶菌酶和胆盐激活酯酶等功能蛋白的转基因奶牛，并且成功纯化出目的重组蛋白，这不仅大大提高了牛奶的品质，同时为利用转基因牛乳腺生物反应器大规模制备功能性重组蛋白打下重要基础［36-39］。由于传统的转基因技术都使用筛选标记基因，然而筛选标记基因往往引起生物安全问题。因此该课题组又建立了无筛选标记基因技术成功制备了不含有抗性筛选标记基因的高效表达重组人溶菌酶及重组人乳铁蛋白的转基因牛［40-41］。这些研究为利用乳腺生物反应器制备的重组功能性蛋白在未来的商业化打下重要基础。同时这些利用常规转基因技术及最新基因组编辑技术对牛奶品质的成功改良，也为最终实现“人源化牛奶”奠定重要基础。

2.3 提高瘦肉率

高瘦肉率，高饲料转化率是肉牛的重要育种目标，比利时蓝牛和皮尔蒙特牛是两种高瘦肉率的肉牛品种，控制肌肉生长的肌抑素基因发生突变是其品种形成的关键，国际上已有多个实验室利用不同基因编辑技术培育出肌抑素基因打靶家畜，包括猪、牛和羊等［42］。

2014年，中国农业大学的Luo等［17］率先利用ZFN技术，对中国冀南黄牛细胞的肌抑素基因进行敲除，获得了双肌臀表型明显的MSTN双等位基因敲除冀南黄牛，其中一个等位基因缺失6 bp，另一个等位基因缺失117 bp，并有一个9 bp的插入突变，单等位基因敲除效率可达20%以上，而双等位基因敲除的效率则达8.3%。之后研究人员将实现了肌抑素基因双等位基因敲除的牛胎儿体细胞进行核移植操作，获得了3头健康存活的肌抑素基因双等位基因敲除冀南黄牛公牛，这些基因敲除公牛1个月内就表现出“双肌”表型，这也是国际上首次获得的肌抑素基因敲除大家畜。美国明尼苏达大学与英国罗斯林研究所合作，利用TALEN对绵羊和牛的肌肉生长抑制素基因进行了基因编辑，首次培育出TALEN介导的基因编辑牛，值得一提的是，该研究是利用卵子收集-体外受精-受精卵显微注射的技术路线，而非体细胞克隆技术［26］。

2.4 去除牛角

给牛去角是养牛业的常规操作，以防止牛只打斗或伤及养殖人员。常用的去角方法包括刀具切割、烙铁烧灼以及化学药物去角等，这些方法不仅耗时，也会给牛只特别是幼牛造成不同程度的伤害或应激，被一些动物保护组织视为不人道的做法。不过，大约500-1 000年前，一些牛群中出现了无角的自然突变［43］，人们相继培育出多个无角牛品种，如安格斯牛就是无角品种。基因检测发现，无角基因位于牛第1号染色体上，有两种等位基因，一种是在荷兰Friesian奶牛中发现的复杂等位基因（PF），在1号染色体的1 909 352-1 989 480 bp处有一个80 128 bp的重复，另一种是在凯尔特牛中发现的简单等位基因（Pc），在1号染色体的1 705 834-1 706 045 bp处有一个212 bp重复代替了第1 706 051-1 706 060 bp的一个10 bp缺失［29］。由于无角性状属于隐性遗传，如果采用杂交等常规育种方法，需要20年以上才能让奶牛群体拥有50%的无角性状，而且无角性状的选择与奶产量等经济性状相冲突。

2013年，美国明尼苏达大学Tan等［25，29］在细胞水平上，利用TALEN技术将Pc无角基因，替换荷斯坦奶牛基因组的等位基因，到2016年该实验室在Nature Biotechnology上报道其成功培育出5头健康存活的基因编辑荷斯坦无角奶牛，包括3头纯合子和2头杂合子，其中两头纯合子10个月大也没有长角。目前该研究小组正在为这些基因编辑无角牛向美国农业部等部门提交申请，希望早日获准上市。

3 关于加快基因编辑农业动物审批的建议

随着基因编辑技术的日趋成熟，奶牛和肉牛育种中将会更多地应用到基因编辑技术。目前我国科学家已培育出无外源基因插入、目标性状突出的β-乳球蛋白基因敲除奶牛和肌抑素基因敲除肉牛等新品系，急需建立一套有别于转基因生物安全监管体系，适合基因编辑动物的安全监管体系，加快基因编辑动物的安全审批，以免我国在基因编辑技术产业化上丧失赶超国际领先水平的机会。

美国宾夕法尼亚州立大学的杨亦农（Yinong Yang）博士率先利用CRISPR/Cas9技术将一个容易引发蘑菇褐变的多酚氧化酶基因敲除，使得该酶的活性降低30%，大大延长了蘑菇保鲜时间。2015年10日底，杨亦农向美国农业部递交了这种不含外源基因的基因编辑蘑菇免除监管的申请，2016年4月美国农业部给杨亦农回信称，决定放开对不含外源基因的基因编辑蘑菇监管［44］。2018年3月28日，美国农业部部长再次宣布不对基因编辑作物进行监管［45］。欧盟也倾向于对基因编辑生物的监管不像转基因生物那样严格［46］。

鉴于美国、欧盟等国际已经出台或正在制定针对基因编辑生物的监管政策，因此建议我国尽快出台相关指导性意见，将基因编辑动物分成两大类，第一类虽然也采用基因编辑技术，但是引入了外源基因，这类基因修饰动物则需要按照转基因生物安全评价和监管体系进行评价和监管；第二类是只对目的基因进行修正或破坏，以及引入与自然突变相同的突变，这类基因编辑动物不含有外源基因，则只需要研发者提供对目标基因编辑、无外源基因导入、无脱靶效应等检测报告，即可准许其进行商业化开发，着重减少审批环节、缩短审批流程，加快审批进度，这样将极大地加速我国基因编辑牛及其它动物产业化进程。

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