地中海贫血的实验室分子诊断技术研究进展

李继慧 覃运荣 梁毅

地中海贫血（简称地贫）是世界上最常见的血红蛋白病之一，主要是由于遗传性珠蛋白基因缺失或点突变导致血红蛋白中一种或一种以上珠蛋白链合成缺失和/或不足而引起的贫血，也称为珠蛋白生成障碍性贫血［1］。按照存在缺陷的珠蛋白基因的种类，地中海贫血一般可以分为α⁃、β⁃、δβ⁃和εγδβ⁃等类型，其中α⁃和β⁃地贫是最为常见的2种地贫类型［1］。地中海贫血好发于地中海、中东、南亚次大陆和东南亚等地区，在我国四川、云南、广西、贵州、广东等南部地区也较为常见［2］。地贫患者具有广泛的临床表现，可从几乎无症状到需要终身输血并伴随多器官系统并发症的重度贫血，并会遗传给下一代，给家庭和社会带来沉重的负担［3］。目前对于地贫的治疗一般是根据其类型采用相应的治疗方案，而α⁃重型地贫（通常是指Hb⁃Bart's胎儿水肿综合征）及β⁃重型地贫尚无有效、经济的治疗方法［4⁃5］。因此使用经济、高效、准确的诊断方法及早对地贫进行筛查和判断其类型，不仅有利于临床对该病的治疗，还能够引导患者及时进行产前诊断，以避免重型地贫患儿的出生，对减缓家庭和社会压力以及实现优生优育具有重要的意义。本文将就目前地贫的实验室分子诊断技术的研究进展进行综述。

1 地中海贫血的分子诊断技术

根据地中海贫血的分子学机制，越来越多的分子诊断技术相继被应用于临床。据报道，多数α⁃地贫（约95%）及部分β地贫（约5%）是由于基因缺失引起的，这些缺失的传统检测方法是印记杂交技术（Southern blot），然而该技术操作繁琐，费时费力，已被基于基因扩增的方法所代替［6］。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是检测缺失型地贫最常用的方法［7］。此外，多种以PCR为基础的分子检测技术可用于已知珠蛋白基因突变的地中海贫血的基因诊断，以及多种其他方法可用于未知突变的地中海贫血基因诊断［8］。

1.1 以PCR为基础的分子诊断技术

1.1.1 裂隙聚合酶链反应

近年来，裂隙聚合酶链反应（gap polymerase chain reaction，Gap⁃PCR）技术已成为普遍应用于已知的、常见的缺失型α⁃地贫的检测手段［9］。其原理是于缺失序列的两端设计一对引物，在正常序列中这对上下游引物间距过远，以至超出有效扩增范围而不能生成扩增产物。大片段缺失的存在会使断端连接，上下游引物靠近，可以生成特定长度的扩增产物［10］。α⁃地贫主要是由于不同长度的基因缺失导致的，可以优先选择Gap⁃PCR进行检测［8］。唐笑等人［11］采用Gap⁃PCR法对湖南地区的7 914 例外周静脉血标本进行α⁃地贫基因缺失检测，检出α地贫1 380例，检出率为17.44%。戴庆福等人［12］对823例血常规指标异常的病人进行地贫基因检测7，采用 Gap⁃PCR 检测 3 种（⁃⁃SEA、⁃α3.7、⁃α4.2）缺失型α⁃地中海贫血，结果1 225例为缺失型α⁃地中海贫血。Gilad等［9］也选择Gap⁃PCR法检测常见的缺失型α⁃地贫，并获得较高的检出率。上述研究团队的结果都显示了Gap⁃PCR法对于常见的缺失型α⁃地贫的检测具有较高的临床应用价值，是实验室检测常见的缺失型α⁃地贫的常用方法。

除了应用于缺失型α⁃地中海贫血基因检测外，Gap⁃PCR法还能诊断一些大片段的β⁃地贫基因缺失［13］。然而，Gap⁃PCR 的结果判读需进行琼脂糖电泳，不但会造成实验室核酸染料污染，而且电泳检测通量非常低并难以自动化，难以应用于大样本量检测［14］。

1.1.2 反向斑点杂交技术

目前，已知的β⁃地中海贫血突变有200种以上，其中以单碱基替换、插入或缺失为主。一些大片段的β⁃基因缺失已经被人们发现，这些大片段的缺失多数可用Gap⁃PCR法进行诊断［13］。而反向斑点杂交技术（reverse⁃dot⁃blotting，RBD），被广泛应用于突变型β⁃地中海贫血的检测，其原理是将扩增的DNA与固定在尼龙扎带上的突变特异性探针杂交［8］。PCR扩增产物和探针通过分子杂交反应及显色反应，观察检测膜条上各位点信号的有无，判断该探针是否与PCR产物杂交，从而确定待检样品的基因型［12］。

1.1.3 其他PCR方法

除了Gap⁃PCR、反向斑点杂交技术外，多种以PCR技术为基础的方法也得到了临床应用。其中，高分辨熔解曲线分析系统是一种高通量的突变筛选方法，是一种全新β⁃地中海贫血突变扫描和基因分析的遗传分析方法，其特点是高特异性和高灵敏度，在大样本、多突变位点筛查上比传统非均一性方法更方便、性价比更高，相比定量探针法突变分析和其他类型快速突变分析法，应用面更广，成本更低［15］。扩增阻滞突变系统（amplification refracto⁃ry mutation system，ARMS）在一些实验室中也得到应用，它快速、经济、方便地同时检测多个突变［8］。

目前，基于PCR法的Gap⁃PCR和反向斑点杂交技术在临床实验室应用成熟，准确度高，且检测成本相对较低，故已作为主流技术得到普及。但其也存在一些缺点，例如实验过程产生污染，操作繁琐，自动化程度低等，尤其是Gap⁃PCR和反向斑点杂交技术目前主要是针对已知的常见地贫类型的检测，对于罕见型地贫等地贫类型检出率低，对于未知类型地贫容易导致漏检。

1.2 多重连接探针扩增技术（multiplex ligation⁃dependent probe amplification，MLPA）

MLPA是一种探针依赖扩增技术，仅需20～200 ng的DNA量，单管即可检测多达50个位点的拷贝数变异［16］。基本原理是把目的基因复制到依赖探针上，再用一对通用引物扩增捕获到的目的片段，通过对扩增产物进行毛细管电泳分析得出目的片段异常的结果。MLPA可快速的定量分析所检测范围内的缺失或重复，且已被证明可以找到经标准诊断仪器检测尚不能找到的已知或者未知的缺失［17］。

对于未知突变的α⁃地贫，仍有部分实验室在使用印记杂交技术；然而MLPA逐渐取代了Southern印记杂交技术，原因是其高灵敏度、高可靠性，且无需使用放射性方法等优点［18］。Yuregir等人［19］对 30名血液学参数提示为α⁃地贫而传统的反向斑点杂交技术（RDB）检测结果为阴性的病人使用MLPA技术检测，结果发现，30名病人中有3人（10%）存在α⁃珠蛋白基因缺失。Gilad等［9］的研究也发现采用Gap⁃PCR法检测常见缺失型α⁃地贫，联合使用MLPA技术检测罕见地贫可提高地贫检出率。由此可见，与常规的基于PCR的技术相比，MLPA对于罕见或未知类型的缺失型α⁃地贫有着更高的检出率。虽然MLPA技术对于突变型地贫的应用有较大的局限性，但如果将常规检测方法与MLPA技术联合使用，就能在一定程度上弥补常规检测方法在罕见或未知缺失型α⁃地贫类型上的空缺，提高检测的准确率，减少漏检的可能。

1.3 基因芯片技术

基因芯片技术的原理是将大量的寡核苷酸片段或DNA片段有序排列在固相载体上，称之为基因芯片或DNA阵列，同时提取待测样品DNA，与芯片杂交，然后扫描芯片的荧光强度，应用生物信息学分析结果，最后得到样品中基因序列和表达水平的相关信息。王沙燕等［20］采用基因芯片技术对40例标本进行β⁃地贫基因检测，结果29例检测出为β⁃地贫的患者，7例为双重杂合子或纯合子。陈林兴等［21］对经初筛为β⁃地贫的32例患者进行基因芯片检测，并与斑点杂交法进行比较分析，结果基因芯片检出32例β⁃地贫，斑点杂交法检出30例，他们认为基因芯片法具有快速、高效、自动化程度高且简便等优点，提倡推广应用。区小冰等［22］应用基因芯片技术对62例初筛诊断为α⁃地贫，93例初筛诊断为β⁃地贫（轻型60例，重型33例）的患儿血样标本进行α及β珠蛋白的基因分析，结果成功检测出中国人中常见的3种缺失型α⁃地贫，2种非缺失型α⁃地贫（HbCS，HbQS）的杂合子、纯合子及双重杂合子。在60例轻型β⁃地贫，33例重型β地贫的126条染色体中共检测到8种突变类型；在60例β⁃地贫杂合子中检测到8例（13.3%）及33例重型β⁃地贫中检测到2例（6%）同时复合有α⁃地贫基因，可见，相对于常规的基于PCR的技术来说，基因芯片技术不仅可以同时检测α⁃与β⁃地贫，具有更高的效率，且自动化程度高。然而，基因芯片技术虽然具有较大的优势，但其作为一种新兴技术应用在地中海贫血检测方面尚不够成熟，较高的检测成本目前也限制其在临床上的大规模推广应用。

1.4 高通量测序

继Sanger测序之后，二代测序（next⁃generation sequencing，NGS）将测序能力从几百个碱基对增加到数千个。NGS基于对克隆扩增的DNA分子大规模并行测序，再加上足够的计算能力和相应的软件进行有效的数据分析，将基因诊断以可承受的价格引入临床实践［23］。它可以应用于整个基因组、全外显子组，以及全基因组的特殊目的范围［23］。

宋春林等［24］以1 368例疑似地中海贫血患者为研究对象，采用二代高通量测序仪进行地中海贫血基因检测，同时以Gap⁃PCR和RDB⁃PCR方法检测常见地贫突变，以Sanger测序验证，结果共检出523例（38.2%）共25种地贫基因突变，使用常规基因检测方法阴性而NGS测序阳性的标本，经Sanger测序验证与NGS结果一致，他们认为高通量测序在地贫检测上值得推广。

然而也有报道称目前文献中未发现NGS技术有可用的珠蛋白基因测序数据［8］。可见NGS技术用于地中海贫血的基因诊断还缺少大量的研究验证。

2 小结

地中海贫血是最常见的具有遗传性的血红蛋白病之一，危害着人类健康，也影响了新生人口的素质。随着医疗水平的不断提高，地中海贫血的检测技术在不断的提升。实验室对于常见的α⁃地贫及β⁃地贫基因检测技术主要是基于PCR法的Gap⁃PCR和反向斑点杂交技术，但这些常规技术也存在一定的局限性，影响着地贫的检出率。随着科技的发展，地中海贫血的致病分子机制不断被发现，各种新技术也随之发展起来，以提高地贫的检出率，如多重连接探针扩增技术、基因芯片技术、高通量测序等技术。而每种技术都有各自的优缺点，如MLPA主要是用来检测缺失型的地贫类型，检测效率较快，成本相对较低，但对于突变型地贫的应用则有较大的局限性；基因芯片及高通量测序的检测深度较高，但同时成本也较高，不适用于大规模的临床推广使用，且基因芯片及高通量测序技术在地贫基因检测上的应用尚不够成熟，在该方面的应用价值还有待更多考究。目前国内多个地中海贫血高发地区享有政府的地贫基因检测补助，尤其是产前诊断，当使用常规的基于PCR法技术来检测时，病人自费比例可以降到很低，甚至免费；而若采用其他方法，特别是基因芯片或高通量测序技术，则产生费用过高而增加病人的负担，病人的依从性可能降低，从而降低了病人的检测积极性，不利于引导地贫患者的产前诊断遗传咨询。此外，是否有必要对病人进行常见的α⁃地贫及β⁃地贫基因以外的地贫基因检测也仍有待探讨。新兴的技术目前或许还不能取代常规的基于PCR法的检测技术，但可以作为常规技术的一种补充，弥补常规技术的不足。因此，充分了解每种技术的应用范围及局限性，结合各自实验室的具体情况，寻找到准确、高效、经济的诊断方案，对于各高发地区预防中重型地中海贫血患儿的出生及提高新生人口素质具有积极且深远的意义。

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