CRISPR/Cas9系统在人类疾病中的研究应用进展

张庆颜 董小玉 臧乃亮 徐伟文

规律成簇的短回文重复序列（clustered regular⁃ly intespaced short palindromic repeats，CRISPR）/（CRISPR associated 9，Cas9）系统是在原核生物中发现的一种适应性免疫机制，现已广泛应用于分子生物学的相关领域，成为继锌指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）和转录激活因子效应物核酸酶（transcription activator⁃like effector nucleases，TALEN）技术后的第三代基因编辑工具。该系统靶向精确、价格低廉、构建简单并可同时操作多个基因，自2013年首次应用以来［1］，迅速发展并被广泛应用于微生物研究、植物科学研究、动物科学研究和人类疾病治疗中，一跃成为当今生物科学领域最具影响力的生物技术之一。本文主要介绍了CRISPR/Cas9系统在疾病模型的建立及在遗传疾病治疗、病毒感染性疾病治疗、癌症研究等方面的进展。

1 CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理

CRISPR由一段高度保守的正向重复序列和长度相似的间隔序列交替排列组成。Cas基因编码的Cas蛋白能与核酶、核酸酶、聚合酶、解旋酶等结合。CRISPR/Cas9系统根据Cas基因的不同分为Ⅰ～Ⅲ3种类型，其中被广泛应用的是Ⅱ型。Ⅱ型CRISPR/Cas9在gRNA（guide RNA）的引导下实现对DNA的定点切割。其中Cas9功能的实现需要CRISPR转录而来的crRNA与CRISPR重复区互补的tracrRNA（trans⁃activating crRNA，tracrRNA）形成的复合物参与［2］。crRNA和tracrRNA融合进一条单链引导RNA（single guide RNA，sgRNA）的设计发明简化了Cas9蛋白对特定DNA的体外定点切割，并将CRIS⁃PR/Cas9技术应用于编码细胞系和模式生物中。

由CRISPR/Cas9介导的基因编辑中，sgRNA通过互补配对识别基因组中的靶向序列（proto⁃spacer），Cas9酶在剪切基因组时于3′端的PAM（protospacer⁃adjacent motif）序列前产生一个双链的切口（图1）。由于细胞内存在非同源末端连接和同源重组2种修复方式，从而实现目标生物基因组任意位点的序列编辑。

2 CRISPR/Cas9在人类疾病研究中的应用

CRISPR/Cas9最引人注目的应用是用于对人类疾病的基因治疗。其中利用CRISPR/Cas9系统对遗传性疾病［3］、病毒感染性疾病［4］及癌症［5］等疾病的基因治疗已有报道。

图1 CRISPR/Cas9的工作原理Figure 1 Mechanism of the CRISPR/Cas9 system

2.1 在疾病模型中的应用

CRISPR/Cas9技术与干细胞结合可快速建立对目标基因修饰的各种生物模型［6］。目前，CRIS⁃PR/Cas9 技术已经广泛应用于细菌［7］、细胞系［8］、斑马鱼［9］、小鼠［10］和猪［11］等模型的建立，成为研究基因功能和人类疾病的重要工具（表1）。

表1 CRISPR/Cas9在疾病模型中的应用Table 1 The applications of the CRISPR/Cas9 in disease models

斑马鱼和小鼠是生命科学研究中重要的模式生物。小鼠模型是研究遗传病血友病乙的重要工具，传统血友病乙小鼠模型构建的方法是用显微注射的方法将凝血因子Ⅸ（factorⅨ，FⅨ）大片段敲除的质粒注入小鼠的受精卵中，经过同源重组后筛选基因敲除小鼠，该方法存在过程繁琐、效率低下和用时较长的弊端。CRISPR/Cas9技术提供了一种构建小鼠模型快捷高效的手段。汪启翰等［18］将小鼠FⅨ基因第8外显子靶位点的sgRNA和特异的Cas9 mRNA显微注射到小鼠受精卵中，获得基因修饰的小鼠。通过精确基因分型和测序验证，小鼠突变率高达85%，突变小鼠的凝血活性缺失。Platt等［16］利用CRISPR/Cas9基因编辑系统在小鼠体内同时实现了p53、Kras、Lkb1基因的突变，成功建立了小鼠肺腺癌动物模型，并由此证实p53、Kras、Lkb1是肺腺癌发生发展中的重要基因。这种基于CRISPR/Cas9技术快速构建多个基因突变的动物模型，对研究肿瘤相关基因的相互作用具有重大意义。斑马鱼模型系统已经处于使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术发展的最前沿，Varshney 等［14］利用CRISPR/Cas9对斑马鱼进行多基因打靶，这种高效高通量打靶方法能快速建立多种疾病模型，可用于筛选致病基因，研究人类基因功能。

CRISPR/Cas9编辑技术与动物克隆技术相结合可减少模式动物的饲养周期，所构建的大型动物模型有助于更好地用于农业和生物医学研究。Zhou 等［17］将靶向特定基因的 Cas/sgRNAs直接导入猪胚胎成纤维细胞，选取纯合突变细胞进行体细胞核移植，通过这种方法成功建立了PARK2⁃/⁃PINK⁃/⁃双等位基因突变帕金森氏病猪模型。科学家们在动物模型中，通过CRISPR/Cas9技术编辑受精卵或早期胚胎中的基因组，或者对生殖干细胞进行基因编辑，从而构建能稳定遗传的基因修饰的新个体［15］。也有科学家将CRISPR/Cas9基因组编辑技术用于构建改良物种模型以防治人类疾病［19］。疟疾是威胁人类健康的重大传染病，阻断蚊虫传播是控制疟疾的关键步骤。美国科学家利用CRISPR/Cas9系统将抗疟原虫基因插入斯氏按蚊胚胎细胞基因组的特定区域，结果表明99.5%的转基因斯氏按蚊后代有抗疟原虫基因的表达，与其他转基因技术相比有更高的效率，并能稳定遗传，这种抗疟原虫斯氏按蚊的成功构建，有助于疟疾传播机制的研究，并有望于改造出用于消灭疟疾的抗疟蚊［19］。

2.2 在遗传病治疗中的应用研究

CRISPR/Cas9技术已应用于基因治疗遗传病研究，修复突变的基因或使基因组中突变的基因失活，有望于从根本上治愈由基因突变引起的遗传病。

隐性营养不良性大疱性表皮松解症（recessive dystrophic epidermolysis bullosa，RDEB）是Col7a1基因发生突变及VII型胶原（collagen VII）蛋白功能异常导致的隐性皮肤遗传病。利用体外成熟的Cas9/sgRNA核糖蛋白复合物在病人特异性的RDEB小鼠表皮干细胞进行成体基因修复已经实现。Wu等［3］利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术从病人特异性的RDEB小鼠模型中筛选出能够特异、高效地介导第80位外显子切除的sgRNAs，然后将Cas9/sgRNA核糖蛋白复合物电击导入皮内并介导体内Col7a1基因的编辑，从而恢复Colla⁃gen VII蛋白功能，并且修复RDEB表型，这为治愈此类遗传性皮肤疾病提供了全新思路。

CRISPR/Cas9技术在镰状细胞性贫血［20］、地中海贫血［21⁃22］、囊性纤维化［23］、杜氏肌营养不良［24］、Crygc基因突变引发的白内障［25⁃26］、遗传酪氨酸血症Ⅰ型、α1⁃抗胰蛋白酶缺乏症等遗传性疾病的应用研究均已有报道。基于高通量测序的发展和精准医疗理念的提出，CRISPR/Cas9技术与人类诱导多能干细胞技术相结合是临床应用的一大趋势［24］。Song 等［21］将地中海贫血患者的皮肤细胞诱导分化为多功能干细胞，再利用CRISPR/Cas9技术成功修复了其中的血红蛋白β⁃球蛋白基因。该多能干细胞分化为造血细胞，生成各类造血祖细胞，最终表达功能正常的β⁃球蛋白。

其他器官系统的成体干细胞或体细胞，同样可利用CRISRP/Cas9技术加以改造，从而实现部分或全部的功能修复。例如，DMD基因突变使肌细胞中的抗肌萎缩蛋白（dystrophin）表达缺失从而导致杜氏肌营养不良综合征（duchenne muscular dystrophy，DMD）。目前CRISPR/Cas9技术应用于DMD的治疗研究已有多项研究报道。例如，Oust⁃erout等［27］利用设计的 sgRNAs靶向外显子 45⁃55的突变热点以恢复肌营养不良蛋白的开放阅读框，并对外显子进行移动或删除操作，成功地纠正了成肌细胞中DMD基因的突变，正常的抗肌萎缩蛋白得以表达。CRISRP/Cas9系统也可应用于某些终末分化的体细胞，Long等［28］利用腺病毒相关病毒在新生DMD小鼠模型的心肌或骨骼肌细胞中特异性表达CRISRP/Cas9系统组分，虽然只有部分抗肌萎缩蛋白表达，心肌和骨骼肌功能却明显改善，从而成功阻断了DMD的进展，这种方法可单独或联合其他疗法治疗DMD，对DMD和其他单基因遗传病有潜在的应用价值。CRISRP/Cas9系统应用于体细胞大大拓展了该技术的临床应用前景。

2.3 在病毒感染性疾病治疗中的应用研究

近年来，基因治疗技术逐渐应用于病毒感染性疾病的治疗中［4］。改造宿主细胞以免受病毒感染或改造病毒使其不能增殖和传播是基因治疗病毒感染性疾病的2种主要思路。艾滋病是人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）引起的传染性疾病，高效抗逆转录病毒疗法是传统治疗艾滋病的方法，虽然这种治疗方法能显著改善患者的病发症状，但仍存在诸多弊端。

长末端重复序列（long terminal repeat，LTR）是HIV病毒核酸的整合和RNA合成必不可少的元件，研究发现针对HIV⁃1感染的T细胞的LTRs利用CRISPR/Cas9系统进行打靶，能有效降低细胞内的前病毒水平［29］。这种基因编辑方法也可以阻止随后的艾滋病毒感染。另外，改造后的CRISPR/Cas9能与潜伏于细胞中的HIV原病毒基因直接结合并使其活化，并同时联合抗病毒药物杀灭活化的HIV病毒。CRISPR/Cas9能够直接作用于细胞表面共受体 CCR5［Chemokine（C⁃C motif）receptor 5］，使细胞免受HIV侵袭，这或许也表明该技术可以在预防HIV病毒感染方面起到贡献。目前，CRIS⁃PR/Cas9基因编辑技术的安全性与稳定性还需进一步鉴定，sgRNAs的脱靶率及原因仍需深入分析，载体的选择也仍需优化，CRISPR/Cas9用于HIV⁃1的真正的临床治疗还有漫长的路要走。

此外，其他病毒感染性疾病的基因治疗研究也不断取得新进展。潜伏病毒感染是治愈病毒感染性疾病的一大障碍，目前大多数抗病毒药物的研究目标是抑制活跃病毒的复制，基因编辑技术有望在控制潜伏病毒感染中发挥作用。Epstein⁃Barr病毒（EB病毒）是疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的成员，这种病毒可导致传染性单核细胞增多症，且与我国南方发病率较高的鼻咽癌以及非洲儿童的淋巴癌有密切关系，被认为可能是人类致癌病毒之一。一项利用CRISPR/Cas9技术对伯奇氏淋巴瘤细胞株中整合的EB病毒进行靶向基因组编辑的研究发现，伯奇氏淋巴瘤细胞出现增殖滞缓现象，且EB病毒载量大大降低了［30］。这提示CRISPR/Cas9在根治病毒感染性疾病方面具有巨大潜力。

2.4 在癌症研究方面的应用研究

CAR⁃T（chimeric antigen receptor T⁃cell immu⁃notherapy，CAR⁃T）免疫疗法通过重新定向和编辑T淋巴细胞以介导肿瘤免疫排斥并特异性结合肿瘤细胞，是治疗肿瘤的一种有效方法。目前CAR⁃T治疗并不完善，CAR基因传递到T细胞的过程，存在随机插入到受体细胞基因组的风险。Eyquem等［5］利用CRISPR/Cas9技术将CAR基因精确地递送到特异的位置，并且增强了CAR⁃T细胞在小鼠中的肿瘤抑制作用，能够长期杀死癌细胞。CRISPR/Cas9编辑过的CAR⁃T细胞在急性淋巴细胞白血病的小鼠模型中的治疗效果要显著优于常规生成的CAR⁃T细胞。但是经CRISPR构建CAR⁃T细胞的安全性和有效性还有待探究。

CRISPR/Cas9技术已成功应用于miRNA在肿瘤中的功能研究。Huo等［31］将靶向miRNA21以慢病毒为载体的CRISPR/Cas9导入卵巢癌细胞SKOV3和OVCAR3中，结果显示卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭均受到抑制，并且编辑后的卵巢癌细胞对化疗药的敏感性显著增加。这表明miR⁃NA21参与调控卵巢癌的发生发展。这种方法可用于研究miRNA与癌症之间的关系并指导癌症的靶向治疗。

此外，利用CRISPR/Cas9技术研究特定基因在癌症发生发展中的作用，可发现新的原癌基因或抑癌基因。Feng等［32］利用CRISPR/Cas9系统有效地敲除了骨肉瘤细胞系的CDK11基因，发现敲除后的细胞活力、细胞增殖能力以及细胞迁移性和侵袭性均显著降低，CDK11基因可能成为骨肉瘤治疗的新靶点。Brandon等［33］首次利用慢病毒载体使CRISPR/Cas9系统导入细胞内并进行高效的编辑，实现了对淋巴瘤癌基因MCL⁃1在体内外的敲除。MCL⁃1基因被敲除后，癌细胞出现了明显的死亡，小鼠体内实验显示肿瘤生长速度减慢并出现了明显的退化。利用CRISPR/Cas9系统对癌基因进行敲除或修复，从而实现肿瘤的基因治疗，这为肿瘤治疗提供了一种潜在方案。然而，CRISPR/Cas9应用于肿瘤治疗仍面临众多挑战，例如脱靶效应的存在，即sgRNA与靶点之外的DNA序列错配，引起非预期的基因突变。如何将CRIS⁃PR/Cas9系统导入靶细胞中也是肿瘤治疗的一大难题。

3 展望

CRISPR/Cas9是一种简洁、灵活和精确的基因编辑技术，CRISPR/Cas9介导的基因组编辑在短时间内崛起并取得众多突破，在生命科学研究领域尤其是在人类疾病基因治疗和作物品质改良方面得到高度关注。

CRISPR/Cas9系统为不同的生物体的基因组编辑提供了可能，但也存在不容忽视的需克服的困难。首先，CRISPR/Cas9系统的分子结构较复杂，目前人们对该系统认识还不够全面，自然界中是否存在更高效率或更精确的变异的Cas9蛋白，有待进一步探究。其次，脱靶效应是CRISPR/Cas9应用于人类疾病治疗最主要的安全问题，虽然选取与人类基因同源性低的片段设计基因编辑病毒的靶标，可一定程度降低脱靶突变率，但脱靶效应依然严重制约了CRISPR/Cas9技术的广泛应用。再次，CRISPR/Cas9能否用于人类生殖细胞的基因编辑，在伦理方面也存在较大争议。最后，CRIS⁃PR/Cas9基因编辑技术对环境和生态平衡也有一定的负面影响，例如，为了控制发展中国家疟疾的传播，对蚊子基因组进行CRISPR/Cas9编辑可能导致短期内目标蚊种的灭绝。总之，CRISPR/Cas9系统的分子生物学研究是一把双刃剑，科研工作者应在尽可能避免和控制其不良影响的前提下将其运用到多种研究中，为人类的健康造福。

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