血清表面抗原检测可能并非评价直接抗乙肝病毒药物临床效果的最好指标

鲁凤民

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）病毒感染仍是全球及我国慢性肝病的重要病因［1］。乙型肝炎病毒（hepatitis B Virus，HBV）DNA的存在形式主要有疏松开链环状DNA（rc⁃DNA）、共价闭合环状DNA（cccDNA）。以不完全双链DNA形式存在的rc⁃DNA存在于具有感染性的Dane颗粒的核衣壳内，是成熟的乙肝病毒的主要存在形式。cccDNA存在于感染肝细胞的细胞核内，为病毒复制的模板。cccDNA的持续存在和活跃转录是HBV慢性感染的病毒学基础，由于现有抗乙肝病毒药物对cccDNA无直接破坏作用，如何彻底治愈CHB仍是一个巨大挑战。

HBV的基因组有S、C、P和X共4个部分重叠的基因编码区，分别编码表面抗原、e抗原和核心抗原、DNA聚合酶（p蛋白）及X蛋白等。其中S区又可划分为前 S1（Pre⁃S1）、前 S2（Pre⁃S2）和 S 基因，对应编码L、M和S 3种HBV包膜蛋白，三者羧基端完全一致，统称 HBsAg［2］。HBsAg 是病毒膜蛋白，既可存在于Dane颗粒表面，也是构成管形和小球形亚病毒颗粒的主要成分。HBsAg是最早被用于急/慢性HBV感染诊断的实验室指标，在实现了血清HBsAg定量检测的同时，检测灵敏度也不断提高（检测下限已达0.05 IU/mL）。定量检测试剂的临床应用为我们打开了一扇新窗，可以观察抗病毒治疗下血清HBsAg的动态变化及其临床意义，大量的临床试验业已证实，与基线水平相比，血清HBsAg的快速下降往往预示着良好的病毒学应答［3⁃4］。

临床上多将肝功能恢复正常、HBsAg消失和/或抗⁃HBs阳转、血清DNA低于检出限称为“功能性治愈（functional cure）”［5］。我国学者将之称为临床治愈（clinical cure）。当患者出现HBsAg消失和/或抗⁃HBs阳转时，其肝组织内的cccDNA往往消失或失去转录活性。当发生血清HBsAg消失后，患者停药后发生HBV DNA反弹和疾病复发的风险大为降低。不仅如此，这些临床治愈患者的终末期肝病和肝癌的发生率明显减少［6］。因此，表面抗原消失被认为是一个理想的治疗终点。遗憾的是，现有药物特别是核苷（酸）类（nucleos（t）ide analogues，NA）药物治疗的慢性乙肝患者HBsAg血清学阴转的发生率很低，仅为每年0.5%～1%［7］，大多数患者不得不终身用药［8］。由于长期使用有副作用之虞，长效干扰素的临床方案多为48周的有限疗程，停药后总的表面抗原累计消失率（3%～7%）虽然略高于NA类药物［9］，但同样并不理想。

最近在Lok和Zoulim等4位教授［10］所领导起草的针对目前慢性乙肝治愈的专家意见里，在提到既往的完全治愈（complete sterilizing cure，指血清中检测不到HBsAg，及肝组织内包括cccDNA和整合DNA的HBV DNA完全清除）难以实现的共识基础上，对功能性治愈（functional cure）也进行了讨论。多数专家对功能性治愈定义为：在限定疗程内，在消除残余肝损伤和降低肝细胞癌风险基础上的血清中HBsAg和HBV DNA的持续消失，可伴有或不伴有血清学转换（抗⁃HBs的阳转）。文中特别提到，部分专家认为功能性治愈还应有cccDNA转录的完全静止、cccDNA的清除（有别于整合DNA的清除）、彻底消除肝损伤和解除肝癌风险。不论是完全治愈或者功能性治愈，血清HBsAg的消失都是实验室判定的最重要指标。

一般而言，血清中的HBsAg主要来自肝细胞核内的cccDNA。但近年来的研究显示，整合的HBV DNA 也会转录翻译产生 HBsAg［11］。HBV DNA的整合在慢性乙肝患者中广泛存在，如Ma⁃son实验室最近的报道表明，HBV DNA整合大量存在于CHB患者的肝细胞中，患者最多可有上亿的肝细胞带有整合病毒DNA片段［12］。目前已知，双链线性HBV DNA（dsl⁃DNA）是病毒整合至宿主基因组的主要来源，其产生与作为正链合成起始引物的前基因组RNA（pgRNA）残端未发生正确的跳转，而在原位起始聚合酶链反应形成大小约3.2 kb的双链线性DNA有关［13］。与其他逆转录病毒不同，整合的HBV DNA并不参与病毒的复制过程，而只是HBV感染过程中的随机事件。众多的研究结果显示，整合病毒DNA片段的断点大都位于病毒基因组的DR1和DR2区域，多保留了完整的编码 HBsAg 的 S 基因区［11，14］。由于 HBeAg 阴性CHB患者病程较HBeAg阳性患者长，发生整合的概率也更大、更加广泛［15］。考虑到整合的HBV DNA同样能转录产生HBsAg，可以认为，在HBeAg阴性CHB患者中，其血清HBsAg水平对病毒复制水平的指示意义并不大。对于长期接受NA药物治疗的患者，尤其是HBeAg转阴后，血清中低水平的HBsAg可能来自于整合型HBV DNA的持续表达，与病毒载量无关，不能提示肝细胞核内存在有转录活性的cccDNA［16］。由此可见，以血清HBsAg的持续消失作为功能性治愈或临床治愈的判定标准，可能会使一些经过长时间NA类药物抗病毒治疗后，肝组织内cccDNA已经耗竭或转录已经完全静默的慢性乙肝患者不得不继续接受长期甚或终生的抗病毒治疗。而实际上，这些患者体内往往并无HBV病毒复制。可能是考虑到了这一现象或问题，也是基于HBsAg消失率过低影响新的抗病毒药物研发的考量，在Lok教授等的专家意见中，也有人提出了“部分治愈”（partial cure）的概念。即经过一定疗程的治疗，患者血清HBV DNA 持续检测不到，但 HBsAg阳性［10］。很显然，现有的新一代核苷（酸）类药物通过抑制病毒P蛋白的逆转录活性和DNA聚合酶活性，可以很容易地使血清中的rc⁃DNA水平快速下降到检测不到的水平。但此时患者肝组织内的cccDNA仍在活跃复制，血清中存在大量的核衣壳内病毒核酸为pgRNA及其变异剪接体的病毒样颗粒，或者核衣壳为空心的颗粒。此时，肝脏因病毒仍在活跃复制而带来的免疫病理损伤可能并未有很好的缓解。来自我国的一项研究显示，在接受NA类药物治疗的慢性乙肝患者，其血清中HBV RNA的水平与患者肝组织的炎性损伤有密切关系［17］。要实现真正意义上的“部分治愈”，除了病毒DNA检测不到、炎症损伤得到控制外，还需保证停药后病毒不反弹。在停药前能够准确预判哪位患者不会出现病毒学反弹，实现安全停药，现阶段仍是一个严峻的挑战。

由于整合的HBV基因组全长仅有3.2 kb，故3.5 kb长的pgRNA不可能来源于整合的HBV片段，只能由cccDNA直接转录产生。相比血清HB⁃sAg水平，血清HBV RNA能够更好地反映肝组织cccDNA的活性。我们实验室近期通过一个小样本的回顾性临床研究显示，接受NA治疗的CHB患者停药点血清HBV RNA的检测结果确实与停药后病毒学反弹发生率密切相关，即停药点血清HBV RNA未检出的患者发生反弹的风险显著降低［18］。据此，我们提出了“安全停药”建议，即对巩固治疗后达到现指南停药标准的患者，加测血清HBV RNA，如果持续阴性，停药后复发的风险会大为下降。当然，这一指标在进入临床并广泛应用之前，还需通过大样本的前瞻性研究。血清HBV RNA作为病毒活跃复制的指标，其意义可能不仅局限于停药预测。考虑到血清HBV RNA能够较好地反映肝组织cccDNA的活性，我们把经过长期NA药物治疗后的cccDNA清除或者处于持续静默，且血清HBsAg低值阳性这一接近于临床治愈的状态称为“准临床治愈”（para⁃functional cure），以有别于HBsAg消失（伴有或不伴有抗⁃HBs阳转）的“临床治愈”或“功能性治愈”［19］。和部分学者提出的部分治愈不同，准临床治愈可以通过检测血清中的HBV RNA来进行判定，使之具有临床实践操作的可行性。建议在未来药物的临床疗效评价中，将之作为一个重要的实验室指标。

最后，需要强调的是，HBV DNA的高频整合也与肝癌发生密切相关［20］。HBV DNA整合入宿主的基因组，通过插入突变破坏宿主基因组的功能或影响其调控［21⁃22］，是 HBV 感染重要的直接致癌机制之一。临床数据也显示，通过抗病毒治疗使患者实现血清HBsAg清除后，发生HCC的风险则可明显减少。因此，研发新药，实现慢性乙肝的临床治愈乃是我们不懈的追求。

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