血液和尿液中砷形态化合物的HPLC-ICP-MS分析

林 琳 ，张素静 ，徐渭聪 ，3，骆如欣 ，马 栋 ，沈 敏

（1.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；2.华东政法大学刑事司法学院，上海 200042；3.南方医科大学公共卫生学院，广东 广州 510515）

砷化合物可分为有机砷化合物与无机砷化合物，砷化合物的毒性因其存在形态不同各有差异。无机砷化合物毒性比有机砷化合物大，且有机砷中三价砷形态化合物毒性是五价砷形态化合物的60倍，是甲基砷化合物（如一甲基砷酸和二甲基砷酸）毒性的70倍[1]。以砷形态化合物的小鼠半数致死量（LD50）计，其毒性顺序从大到小依次为：砷化氢（arsenic hydride，AsH3）、亚砷酸盐［arsenite，As（Ⅲ）］、砷酸盐 ［arsenate，As（Ⅴ）］、一甲基胂酸（monomethylarsonic acid，MMA）、二甲基胂酸（dimethylarsinic acid，DMA）、三甲基胂氧（trimethylarsine oxide，TMAO）、砷胆碱（arsenocholine，AsC）、砷甜菜碱（arsenobetaine，AsB）[2]，后两者通常被认为无毒[3]。在法医学鉴定实践中，一般以总砷含量作为砷中毒判别的依据。由于不同砷形态化合物的生物毒性不同[2-3]，仅以检测总砷含量为手段来评价法医毒物层面的砷中毒是不严谨的。因此，建立以砷形态化合物含量为基础的新评价体系对于砷中毒的法医学评价十分必要。

目前砷形态化合物的检测技术通常有原子荧光光谱法[4-6]、等离子体原子发射光谱法[7]、氢化物发生-原子吸收光谱联用技术[8]、毛细管电泳-原子荧光光谱联用技术[9]、离子色谱-质谱联用技术[10-15]等。高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（high-performance liquid chromatography-inductively coupled plasmamass spectrometry，HPLC-ICP-MS）联用技术结合了HPLC对复杂样品高效的分离特点与ICP-MS动态线性范围宽、检测灵敏度高等优点，在砷化合物检测及形态分析中得到广泛应用。因此，本研究拟采用该技术建立以人体生物样本（血液、尿液）为检材的6种砷形态化合物的分析方法，为相关案件的解决提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

7500Ce电感耦合等离子体质谱仪（美国Agilent公司），Infinity 1260液相色谱仪（美国Agilent公司），Milli-Q Advantage A10超纯水处理系统（美国Millipore公司），TDZ4-WS离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），Centrifuge 5810R冷冻离心机（德国Eppendorf公司），15 mL聚丙烯试管（美国Corning公司），SHZ-Ⅲ循环水真空泵（上海华光仪器仪表厂）。

碳酸铵［ammonium carbonate，（NH4）2CO3］，优级纯；乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate，EDTA·2Na·2H2O），色谱纯；乙腈（acetonitrile），色谱纯；曲拉通（triton），色谱纯；实验用水为超纯水；砷形态化合物标准物质亚砷酸根离子［As（Ⅲ），1 000 mg/kg，以 As计］、砷酸根离子［As（Ⅴ），1 000 mg/kg，以 As 计］、MMA（257 mg/kg，以 As 计 ）、DMA（542 mg/kg，以 As计）、砷甜菜碱（AsB，426 mg/kg，以 As 计）、砷胆碱（AsC，315 mg/kg，以 As计），均购于国家标准物质中心；空白血液由上海市血液中心提供。

1.2 溶液配制

标准品溶液：分别量取 0.5mL As（Ⅲ）、As（Ⅴ）标准物质于15 mL聚丙烯试管，加入4.5 mL 50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液配制成 100mg/L 的 As（Ⅲ）、As（Ⅴ）标准品溶液；量取1mL MMA标准物质于15mL聚丙烯试管，加入 1.57 mL 50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O溶液配制成100 mg/L的MMA标准品溶液；量取1 mL DMA标准物质于15 mL聚丙烯试管，加入4.42 mL 50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液配制成100 mg/L的DMA标准品溶液；量取1 mL AsB标准物质于15 mL聚丙烯试管，加入3.26 mL 50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O溶液配制成100 mg/L的AsB标准品溶液；量取1 mL AsC标准物质于15 mL聚丙烯试管，加入 2.15mL 50mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液配制成100mg/L的AsC标准品溶液。

混合标准品溶液：各取0.5mL的砷标准品溶液，添加 2 mL 50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液配制10mg/L的混合标准品溶液，依次添加适量的50mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液配制成 5、2.5、1、0.5、0.3、0.15、0.1、0.05mg/L的混合标准品溶液。

50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液：称取 4.65 g EDTA·2Na·2H2O置于250mL容量瓶中，加入超纯水溶解并定容至刻度，充分溶解。

50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O 溶液（含 0.1%曲拉通）：量取0.5 mL曲拉通置于50 mL容量瓶中，加入超纯水至刻度线，配制1%曲拉通溶液；称取4.65 g EDTA·2Na·2H2O，量取 25 mL 1%曲拉通溶液，置于250mL容量瓶中，加入超纯水至刻度，充分溶解。

100mmol/L碳酸铵水溶液（pH=9.5）：称取碳酸铵9.60g与1000mL超纯水搅拌溶解，再加入适量HNO3，调至pH=9.5。

1.3 色谱与质谱条件

HPLC条件：Hamilton PRP-X100阴离子分析柱（4.1 mm×250 mm，10 μm）以及 PRP-X100 预柱（2.1 mm×20 mm）；以 100 mmol/L 碳酸铵水溶液（pH=9.5）和超纯水作为流动相，梯度洗脱程序见表1；流速为1.0mL/min；柱温为25℃；进样体积为10μL。

表1 流动相梯度洗脱程序 （%）

ICP-MS条件：射频入射功率1 500 W，载气为高纯氩气，载气流速0.88 L/min，辅助气流速0.1 L/min，射频电压1.71 V，采样深度7.0 mm，泵速0.3 r/s，检测时间0.08s，分析时间为1220s。

1.4 样品前处理

取500 μL血液或尿液样品与500 μL含0.1%曲拉通的50mmol/L EDTA·2Na溶液混合，涡旋30s后超声 40 min，并以离心半径 12 cm，3 500 r/min，离心10min，按上清液与乙腈等体积比进行混合涡旋5min后，4℃下以离心半径 9.5cm，14000r/min，离心 5min，取上清液直接进样。

1.5 方法学验证

对所建立的方法进行方法学验证，考察其线性、灵敏度、准确度、精密度、提取回收率、基质效应、稳定性等。

线性关系、检测限和定量限：将不同浓度的6种砷形态化合物混合标准溶液添加至空白血液、超纯水，按1.4节前处理方法对样品处理后，用HPLCICP-MS进行检测，以砷形态化合物浓度的响应值（y）为因变量，以相应形态砷含量（x，ng/mL）为自变量，得到各形态砷化合物的线性回归方程及决定系数（R2），按信噪比（S/N）≥3，确定各形态砷化合物的检测限[16]，以S/N≥10，同时满足准确度和精密度要求的样品最低浓度为定量限。

方法准确度和精密度：取空白血液、超纯水500 μL，添加不同浓度的混合标准品溶液，分别配制成低、中、高质量浓度的质控样品，每个质量浓度点6份样品，按照1.4节前处理方法处理，在1.3节色谱和质谱条件下分析，连续4d，考察其方法准确度、日内精密度、日间精密度[16]。

提取回收率、基质效应：按照MATUSZEWSKI等[17]的方法，选取空白血液为基质，采用低、高两个浓度点，以定量限为低浓度点，以800ng/mL为高浓度点，以空白血液提取后添加混合标准品溶液与对应浓度混合标准品溶液的峰面积比值为基质效应（n=5），以空白血液提取前添加混合标准品溶液与对应浓度混合标准品溶液的峰面积比值为提取回收率（n=5）。

稳定性：本方法考察室温稳定性[16]，取低、中、高3个浓度点，每个浓度点6个样品，室温25℃放置24h，考察其室温稳定性。本方法同时也考察了反复冻融稳定性，取低、中、高三个浓度点，每个浓度点6个重复质控样品，经过3个反复冻融循环（-20℃到室温25℃）：首先-20℃冷冻21 h，然后融化，室温放置3h。分别按照1.4节前处理方法处理，在1.3节色谱和质谱条件下分析，根据当日工作曲线检测样品浓度。

2 结 果

2.1 方法优化

2.1.1 样品前处理优化

由于尿液中砷形态化合物个体差异性大，且与饮食密切相关，另尿液基质简单，其组成95%～97%是水，因此依据现有HPLC-ICP-MS联用技术应用于尿液分析的相关研究[18]，本研究以超纯水为基质添加混合标准品溶液建立尿液中砷形态化合物的分析方法。

基于砷化合物易与血红蛋白相结合的特性，本方法中的前处理条件中，稀释血液、尿液样品采用配制的含 0.1%曲拉通的 50 mmol/L EDTA·2Na·2H2O溶液，其中曲拉通具有破坏细胞的作用，EDTA·2Na·2H2O可与砷形态化合物络合；针对沉淀血红蛋白的试剂，分别考察了 5%～10%乙酸[12]、甲醇[2]和乙腈[9]，其中乙腈沉淀效果明显。故选用0.1%曲拉通与50mmol/L EDTA·2Na·2H2O溶液稀释络合，乙腈沉淀。

2.1.2 色谱条件的优化

尝试以磷酸二氢钠和碳酸铵作为流动相，其中磷酸二氢钠易残留磷酸盐，故选用碳酸铵为流动相A；考察不同浓度（50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200mmol/L）的碳酸铵溶液，结果见图1。根据砷形态化合物的分离效果，确定流动相为100 mmol/L碳酸铵水溶液（pH=9.5）和超纯水，进行梯度洗脱。

图1 不同浓度碳酸铵溶液作为流动相的分离效果

图2 6种砷形态化合物的色谱图

2.2 方法学验证

2.2.1 选择性、线性范围、检测限、定量限

空白血液中添加6种砷形态化合物（100ng/mL）的色谱图见图2，其 AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）保留时间分别为 1.80、2.30、5.15、5.94、10.95、12.61min。在血液、尿液中相应的线性范围线性良好，其线性回归方程及相关系数、检测限、定量限见表2～3。

表2 血液中各砷形态化合物检测限、定量限及线性关系

表3 尿液中各砷形态化合物检测限、定量限及线性关系

2.2.2 准确度、精密度

本方法在血液和尿液的准确度分别为97.2%～108.3%、93.0%～110.5%，日内精密度分别为0.5%～4.5%、1.0%～6.4%，日间精密度分别为1.3%～6.1%、1.0%～7.1%，具体结果见表4～5。方法学验证要求准确度满足在85%～115%，方法精密度的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）应控制在 15%[16]，本方法准确度、精密度均符合方法学验证的要求。

2.2.3 提取回收率、基质效应

血液中砷形态分析采用空白血液直接添加砷形态化合物标准品，因此需考虑空白血液对砷形态化合物的基质效应和提取回收率。本研究结果显示，基质效应为86.4%～118.2%，提取回收率为90.2%～104.7%。

2.2.4 稳定性

考察其室温稳定性，血液样品RSD为1.2%～7.3%，超纯水为基质添加混合标准品溶液的RSD为0.8%～3.3%。考察其反复冻融稳定性，血液样品反复冻融稳定性RSD为0.8%～7.3%，超纯水为基质添加混合标准品溶液的样品稳定性RSD为0.5%～4.2%，表明砷形态化合物稳定性良好。

表4 血液中砷形态化合物的精密度和准确度

表5 尿液中砷形态化合物的精密度和准确度

2.3 案例应用

2.3.1 应用一

死者，女，因食海鲜不适送医救治，经救治无效死亡，就医期间曾注射维生素C，家属通过网络查询，认为维生素C与海鲜中含有的砷化合物可形成As（Ⅲ）致死，故抽样送检。对所取的血浆进行砷形态检测，检出AsB和As（Ⅴ）两种砷形态化合物，其中AsB检出含量低于定量限，As（Ⅴ）含量为34.75ng/mL；采用总砷检测方法[18]，用硝酸消解后检测总砷含量为40.05ng/mL。

表6 食用海鲜组尿液中砷形态化合物含量（ng/mL）

2.3.2 应用二

选取20名健康志愿者，年龄为20～30岁，男女性比例为1∶1，分为食用海鲜组和未食用海鲜组，每组男、女性各5名。食用海鲜组在3 d内食用过海鲜类食物，未食用海鲜组为两周内未食用过海鲜类食物。收集两组的尿液，检测各砷形态化合物的含量，结果见表6～7。

表7 未食用海鲜组尿液中砷形态化合物含量（ng/mL）

2.3.3 应用三

患者，男童，因患急性早幼粒细胞白血病送医救治，停止服用砷剂治疗2 d后采集其血样和尿样，其中总砷方法检测[18]血样中总砷含量为10.53ng/mL，尿样中总砷含量为75.07ng/mL。本形态分析方法检出血样中仅有As（Ⅴ），但低于定量限，尿样中检出AsB、DMA、MMA、As（Ⅴ），其中 AsB、MMA、As（Ⅴ）低于定量限，DMA检出含量为53.21ng/mL。

3 讨 论

本研究建立了血液和尿液中6种极性不同的砷形态化合物的HPLC-ICP-MS检测方法，方法检测限低于10 ng/mL，最低定量限低于30 ng/mL，本分析方法可用于砷中毒相关案件中，结合传统的总砷含量测定方法可对相应案件进行更有效、更准确的法医学评价。

应用一检测结果表明：本方法并未检出毒性强的As（Ⅲ），且检出的AsB及As（Ⅴ）砷形态化合物含量未达到致死量[19]。总砷检测方法检测出的总砷含量与本方法检测出的各砷形态化合物含量总和接近。因此，可推论该患者并不是因为砷中毒而死亡，此案件中食用海鲜与注射维生素C在体内并不会产生As（Ⅲ）。

应用二中，食用海鲜组尿液中有2例检测出As（Ⅲ）砷形态化合物，但低于定量限，未食用海鲜组尿液中未检出As（Ⅲ）；食用海鲜组尿液中检出AsB平均含量是未食用海鲜组的2.38倍，DMA平均含量是未食用海鲜组的1.89倍；食用海鲜组尿液中7例检出MMA，而未食用海鲜组中仅4例检出MMA；无严重的砷暴露情况下，尿液中总砷含量为5～50 ng/mL[20]，而食用海鲜组中有1人总砷含量为76.97ng/mL。综上，本实验结果显示，志愿者尿液中均含有内源性的砷形态化合物，食用海鲜组总砷含量高于未食用海鲜组，证实食用海鲜类产品会导致尿液中总砷含量增加，尿液中砷形态化合物含量与食用海鲜存在一定的关联；食用海鲜组尿液中检出的砷形态化合物主要是有机砷化合物，虽有2例检出As（Ⅲ），但无机砷化合物总含量远远低于中毒量，从而进一步证实，海鲜中砷化合物90%以上为有机砷化合物[21]，对人体并不会造成器质性损害。

应用三的检测结果符合文献报道[20]中研究成果：砷化合物在血液中代谢较为快速，在几小时后即可消除，而尿液中砷化合物半衰期较长，约为4d。其次，本研究所建立的砷化合物形态分析方法可阐明注射砷剂［As（Ⅲ）］进入人体后的代谢过程。 As（Ⅲ）在人体内进行甲基化反应，代谢产物主要为DMA，符合报道[20]中As（Ⅲ）代谢机理。本研究证明，该形态分析方法实时监测相关急性早幼粒细胞白血病患者治疗过程中砷剂体内代谢的可行性，可根据其检测结果制定或调整砷剂治疗方案。

通过上述案例应用，本研究可以检测6种砷形态化合物在体内的含量，与总砷检测方法结合可以检测样本中总砷和砷形态化合物，两者相互印证为司法鉴定提供可靠、科学的数据支持。

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