Nrf2蛋白在骨骼肌损伤修复中的时序性表达及作用

张小红 ，刘 季 ，李 娜 ，杜秋香 ，王英元 ，孙俊红

（1.山西医科大学法医学院，山西 太原 030001；2.邹平县公安局，山东 邹平 256200；3.广州市公安局交通警察支队，广东 广州 510000）

损伤时间推断是法医病理学研究的重点及难点之一，损伤时间的研究虽然取得了很多成果[1-3]，但在实践中应用较有限，探索理想指标仍是目前研究的主要任务。骨骼肌损伤在法医学实践中很常见，而氧化应激信号通路是机体损伤后的重要保护机制之一，因此，本研究选择骨骼肌和氧化应激信号通路进行观察。核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是氧化应激信号通路中的一种关键蛋白。正常状态下，其在胞质中与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）结合，活性被抑制。当炎症、辐射等有害刺激引起细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累时，引起Nrf2与Keap1解离，游离的Nrf2进入细胞核内蓄积，与抗氧化元件（antioxidant responsive element，ARE）结合，诱导解毒酶及抗氧化蛋白高表达，对机体起保护作用。

研究[4-5]表明，氧化应激信号通路在多种细胞的损伤与修复过程中起重要作用，作为该通路的关键信号分子ROS和Nrf2在肌肉损伤后的变化规律、机制及是否能够用于损伤时间推断有待于进一步研究。心脏毒素（cardiotoxin，CTX）制作骨骼肌损伤模型具有损伤程度和范围易于控制的优点[6-7]，目前被广泛用于骨骼肌损伤修复研究。因此，本研究采用大鼠腓肠肌内注射CTX造模，观察骨骼肌修复过程中组织形态学变化，探索氧化应激信号通路中关键蛋白Nrf2及重要因子ROS的表达变化规律，以期找到理想的损伤时间推断指标。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

心脏毒素（cardiotoxin，CTX，ZX0005）购自广州威佳科技有限公司，2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2’，7’-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFHDA，35845）购自美国Sigma公司，兔抗大鼠Nrf2抗体（sc-722）、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-驴抗兔抗体（sc-2090）购自美国 Santa Cruz公司，哺乳动物组织总蛋白提取试剂（AR0101）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（AR0146）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液 5×（AR1112）、彩色预染蛋白 marker（10000～170000）、5%牛血清白蛋白封闭液（bovine serum albumin，BSA，AR0004）、增强型化学发光（enhanced chemiluminescent，ECL）底物（AR1170）、硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane，NC）、4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6’-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液（AR1176）、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 抗 体 （BA2913）、 辣 根 过 氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）-羊抗兔 IgG（BA1054）均购自武汉博士德生物工程有限公司。

Infinite M200 Pro多功能酶标仪（瑞士Tecan公司），2-16PK型低温高速离心机（美国Sigma公司），电泳转印两用仪（美国C.B.S集团有限公司），BioSpectrum凝胶成像系统（美国UVP公司），RM2135型石蜡切片机（德国Leica公司），BX61型荧光显微镜、BH-2型光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 实验动物分组及损伤模型制备

健康成年雄性SD大鼠84只，10～12周龄，体质量220～250g，由山西医科大学实验动物中心提供，在山西医科大学法医学院动物室分笼饲养，自由进食和饮水，光照12 h/d，随机分为正常对照组和损伤后1 h、4 h、8 h、12 h、16 h、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、13 d、17 d、21 d组，共14组，每组6只。

损伤后大鼠用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉，剪去毛发，用75%乙醇溶液消毒后，于大鼠左下肢腓肠肌内注射45μL CTX，建模成功后与正常对照组一起常规饲养。

在各损伤时间脱颈处死大鼠，迅速切取左下肢腓肠肌组织：部分用4%多聚甲醛溶液固定，用于HE染色及免疫荧光染色；部分用液氮速冻后于-80℃低温保存，用于ROS含量检测及Western印迹法检测。

正常对照组大鼠不做处理，处死方法、取材部位及实验方法同损伤组。

1.3 HE染色

取损伤区肌肉用4%多聚甲醛溶液固定24h后，脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋，制作4μm切片。切片经脱蜡、水化后，进行苏木素-伊红染色，在BH-2型光学显微镜下观察。

1.4 ROS相对含量检测

取各组肌肉组织，称重后用液氮低温研磨，按肌肉质量（g）∶PBS 体积（mL）＝1∶4 的比例加入 PBS，充分振荡后，4℃下，1000×g离心10min，提取上清液。 用BCA法测定所提取各组上清液蛋白浓度并将各组上清液稀释至相同浓度。取190μL上清液及10μL DCFH-DA（0.1μmol）在荧光酶标板中混匀，37℃反应30min。DCFH-DA进入细胞内后，被细胞内的酯酶水解生成DCFH，细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的二氯荧光素（dichlorofluorescein，DCF），用酶标仪测量DCF的荧光值，即为组织中ROS相对含量。

1.5 蛋白样品制备及Western印迹法检测

取低温保存的各组肌组织，称重后用液氮低温研磨，按肌肉质量（g）∶哺乳动物组织总蛋白提取试剂体积（mL）＝1∶4的比例充分振荡混匀，4℃下反应90min，1000×g离心 10min，提取上清液。 用 BCA 法测定各组上清液蛋白浓度并稀释至同一蛋白浓度，按4∶1的体积比例加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5×，100℃煮沸5min。制作电泳凝胶，上样、电泳，170mA转印50 min，5%BSA封闭2 h，将NC膜上目的蛋白区和内参蛋白区剪开，分别滴加一抗（1∶200兔抗大鼠Nrf2抗体、1∶5 000兔抗大鼠GAPDH抗体）4℃孵育过夜，再分别滴加二抗（1∶2000 HRP-羊抗兔 IgG）室温孵育2h，与ECL底物反应，用BioSpectrum凝胶成像系统拍照、测量。

1.6 免疫荧光染色

取1.3节所述切片经脱蜡、水化后，进行免疫荧光染色：0.3%TritonX-100透膜，枸橼酸微波修复，5%BSA封闭液封闭，滴加1∶200兔抗大鼠Nrf2抗体4℃孵育过夜，水洗后滴加1∶200 FITC-驴抗兔抗体室温避光孵育1h，滴加DAPI染色液室温孵育10min染核、抗荧光衰减剂封片。阴性对照采用PBS代替一抗。使用荧光显微镜拍照后，利用Image-Pro Plus 6.0软件计算各组Nrf2阳性核率（Nrf2阳性细胞核数/总细胞核数），以表示Nrf2蛋白在细胞核内表达水平。

1.7 统计学分析

用 SPSS 16.0、Image-Pro Plus 6.0、BioSpectrum凝胶成像系统软件对实验数据进行统计分析。Nrf2阳性核率用百分率表示，进行卡方检验；ROS相对含量及Western印迹法检测数据用±s表示，采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 大鼠骨骼肌损伤修复过程的形态学变化

行HE染色观察，在损伤后4 h即可看到骨骼肌细胞明显水肿、坏死，有少量中性粒细胞浸润，在损伤后16h中性粒细胞明显增多，1d达高峰。损伤后3d炎症细胞浸润以单核细胞为主，并伴有新生毛细血管及较多的成纤维细胞。损伤后5d可见大量核位于胞质中央的新生肌细胞出现，13d时大量新生肌细胞融合为肌管，至21d时肌细胞分化成熟，细胞横径基本接近正常肌细胞，核位于细胞膜下（图1）。

2.2 大鼠骨骼肌损伤后ROS相对含量变化

与正常对照组相比，骨骼肌损伤后ROS相对含量在损伤后12h减少（P＜0.05），其余各组变化差异无统计学意义（表1）。

2.3 大鼠骨骼肌损伤后Nrf2蛋白表达变化

用Western印迹法检测Nrf2蛋白表达情况，结果见图2。与正常对照组相比，骨骼肌组织仅损伤后16h表达升高具有统计学意义（P＜0.05），其余各组Nrf2蛋白变化差异均无统计学意义。

图1 大鼠骨骼肌损伤修复过程中的病理学改变 HE×200

表1 大鼠骨骼肌损伤后ROS相对含量及Nrf2 阳性核率 （n=6，±s）

表1 大鼠骨骼肌损伤后ROS相对含量及Nrf2 阳性核率 （n=6，±s）

注：1）与正常对照组比较，P＜0.05；2）与相邻上组比较，P＜0.05

组别 ROS相对含量 Nrf2阳性核率/%正常对照 1.00±0.00 13.46±0.01损伤后 1h 0.83±0.31 23.99±0.061）损伤后 4h 0.77±0.20 20.93±0.041）2）损伤后 8h 0.75±0.22 22.79±0.061）损伤后 12h 0.74±0.371） 25.95±0.161）2）损伤后 16h 0.86±0.23 31.46±0.041）2）损伤后 1d 0.95±0.14 33.36±0.081）损伤后 3d 1.00±0.07 30.59±0.061）2）损伤后 5d 1.03±0.19 29.19±0.101）损伤后 7d 1.10±0.12 25.05±0.081）2）损伤后 9d 1.19±0.33 21.37±0.101）2）损伤后 13d 1.12±0.17 16.28±0.071）2）损伤后 17d 0.98±0.15 14.06±0.03损伤后 21d 0.99±0.18 13.91±0.11

图2 骨骼肌损伤后不同时间点Nrf2蛋白表达量

2.4 Nrf2蛋白在骨骼肌损伤后阳性核率比较

对各组骨骼肌组织进行免疫荧光染色，Nrf2蛋白呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光，当绿色荧光与蓝色荧光重叠表示Nrf2蛋白位于细胞核内。由图3可见，在骨骼肌损伤后Nrf2蛋白染色阳性的细胞核比正常对照组增多，并随损伤时间呈先增高后减少的变化。

对各组骨骼肌Nrf2阳性核率进行统计分析（表1），与正常对照组相比，在骨骼肌损伤后除17d、21d外，其余时间点Nrf2阳性核率均升高（P＜0.05）；各损伤组与相邻上组比较，除4h与8h、16h与1d、3d与5d、13 d与17 d、17 d与21 d 5组外，其余各相临两组间差异均有统计学意义（P＜0.05），并且Nrf2阳性核率呈先增高后降低的变化规律，在16h～1d达到峰值。

图3 骨骼肌免疫荧光染色 ×400

3 讨 论

氧化应激信号通路对细胞的代谢活动起重要调节作用，参与组织细胞抗氧化、炎症、衰老及凋亡等病理生理过程，此通路包含一个重要的转录因子Nrf2和一个重要的细胞内信号分子ROS[4-5，8-13]。HORIE等[8]用电刺激小鼠C2C12细胞，刺激停止后，增加的ROS在1h内迅速降至对照水平；有研究者[9]用·NO（活性氧）刺激HCT116细胞，发现细胞核内Nrf2从停止刺激后4h开始升高，24h升高到131%，说明ROS代谢迅速，但短时间内增多可诱导Nrf2蛋白发生核转位。但信号分子ROS在损伤后是否持续处于高水平以维持细胞核内Nrf2蛋白水平以及损伤后Nrf2蛋白的核转位机制尚不清楚。本研究结果显示，信号分子ROS和组织中Nrf2蛋白在损伤1h后与正常对照组差异无统计学意义。而Nrf2阳性核率显著增高，说明氧化应激信号通路在修复过程中被激活，而ROS仅在损伤早期（1h内）起“开关样”激活作用，Nrf2并不是通过蛋白表达增多，而是通过Nrf2蛋白的核转位实现对其下游代谢的调节。本实验结果从另一方面也表明，在肌肉损伤1h后检测信号分子ROS的含量变化对损伤时间推断应用价值不大。

文献[5，11，14-17]报道，Nrf2 蛋白具有抗感染、促进肌卫星细胞分化和增殖、抑制衰老等作用。结合HE染色发现，细胞核内Nrf2蛋白高表达正处于炎症反应、细胞增殖、分化阶段，随肌细胞成熟而恢复到对照水平，说明Nrf2参与了骨骼肌损伤后的炎症反应、肌卫星细胞的增殖分化及成熟的过程，具有促进损伤修复的作用。

Nrf2阳性核率在损伤后1 h～13 d均高于正常对照组，在16h～1d达峰值，在17d降至对照水平，具有随损伤时间先升后降的时序性变化规律。HE染色显示，在损伤1 d内主要表现为坏死及炎症反应，3 d后主要是组织修复，因此，可将Nrf2阳性核率变化与HE染色相结合，用于损伤时间推断。当然使用此指标仍具有推断时间跨度大的局限性，后续研究可以寻找其他mRNA及蛋白指标结合应用来缩短损伤时间推断的时间窗并提高准确性。

本研究发现，在骨骼肌损伤后，氧化应激信号通路关键蛋白Nrf2阳性核率随骨骼肌的损伤修复过程呈时序性变化，说明其参与此过程，并且其变化规律可用于骨骼肌损伤时间推断。

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