混合效应模型在玻璃体液推断死亡时间中的应用

杨明真，李辉军，张天叶 ，丁自娇，吴士凡，邱鑫罡，刘 茜

（1.华中科技大学同济医学院法医学系，湖北 武汉 430030；2.华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，湖北 武汉 430030；3.上海市公安局物证鉴定中心 上海市现场物证重点实验室，上海 200083）

死亡时间（postmortem interval，PMI）推断对刑事死亡案件及自然死亡均具有重要的意义，是法医学者面临的最具挑战性的问题之一[1]。在法医学实践中，PMI推断受诸多因素的影响，在所有影响PMI推断的因素中，以环境温度的影响最大[2]。玻璃体液（vitreous humor，VH）用于推断PMI研究已有50余年，很多学者应用新方法检测VH中各种物质浓度，并建立了PMI的推导方程，使VH推断PMI的研究不断深入[2-6]。随着生化检测技术不断发展，更多的拟合方法和数学模型用于PMI推断，为解决PMI推断中的难题提供了新思路。

本课题组早期证实了VH内K+、Mg2+与PMI具有强相关性[7]，本研究就不同温度条件影响PMI推断的问题进行观察，在以VH中K+、Mg2+浓度和PMI为变量基础上，引入环境温度变量，应用混合效应模型的理论和方法，探讨在一定外界环境温度（5℃～35℃）内，家兔眼VH中K+、Mg2+浓度的死后变化与 PMI的关系，建立一种可应用于不同外界环境温度条件下的PMI推断方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康成年家兔58只（华中科技大学同济医学院实验动物中心提供），雌雄不限，体质量1 600～2 500 g，其中40只按随机原则分为5℃、15℃、25℃、35℃四个实验组，每组10只。家兔以耳缘静脉空气栓塞法处死，分别置于CTHI-100恒温恒湿箱［施都凯仪器设备（上海）有限公司］5℃、15℃、25℃、35℃环境下，温度波动度±1.0℃，湿度范围25%～70%。其余18只按随机原则分为10℃、20℃、30℃三个验证组，每组6只，以上述方法处死后分别置于10℃、20℃、30℃的恒温恒湿箱内。

1.2 取样

采用刘茜等[7]报道的双眼交替微量取样方法，对实验组各组家兔进行双眼交替微量取样，左眼于死后 0、24、48、72、96、120 h，右眼于死后 12、36、60、84、108h，分别取 VH 80～100μL。 验证组于死后 20、40、65h分别取VH 80～100μL。舍弃浑浊或混有血液的样本，合格样本于微量离心管中-80℃保存，2周内检测。高温环境（25℃、35℃）下，因腐败速度快，取材仅持续至死后72h。

1.3 样本检测与统计分析

室温解冻后，取60μL样本于检测瓶内，按V样本∶V去离子水=1∶4 对样本进行稀释，应用 Cobas®c701 罗氏生化免疫分析仪［罗氏诊断产品（上海）有限公司］检测实验组VH中K+、Mg2+的浓度。所有数据以±s表示，观察K+、Mg2+浓度的变化趋势。应用SAS 9.3软件进行混合效应模型的数值分析，并以PMI为自变量x，温度为自变量y，各离子浓度为因变量f（x，y）拟合方程。检验水准α=0.0001。

1.4 验证组验证

将各验证组VH中K+、Mg2+检测值分别带入相应方程内，应用Excel 2010计算PMI值。将推测的PMI值与实际值相减得到残差，计算同一时间点上的6个残差绝对值的均值得到各时间点的平均偏离时间。平均偏离时间与对应的PMI相比得到各时间点推测的平均偏离率。

2 结 果

2.1 样本检测结果

各组K+、Mg2+浓度随PMI延长呈上升趋势，各组K+浓度检测值见表1，Mg2+浓度检测值见表2。由于高温（25℃和35℃）条件下，玻璃体腐败加快，至72h后已无法提取VH。

2.2 混合效应模型拟合结果

经混合效应模型拟合后，K+、Mg2+浓度的固定效应参数估计与比较及三种固定效应假设检验的结果见表3～4。

表1 不同温度下家兔VH中K+浓度检测结果 （±s，mmol/L）

表1 不同温度下家兔VH中K+浓度检测结果 （±s，mmol/L）

注：“-”为缺失值

PMI/h 5℃（n=10） 15℃（n=10） 25℃（n=10） 35℃（n=10）0 9.39±0.44 9.49±0.26 9.55±0.42 9.38±0.18 12 10.91±0.92 10.81±0.65 17.03±1.06 20.77±0.84 24 14.12±0.99 16.14±0.84 27.99±1.41 37.37±2.08 36 17.47±0.93 19.53±0.95 36.34±2.53 44.13±1.92 48 19.33±1.40 26.05±1.29 44.65±1.71 52.41±2.46 60 22.14±0.89 30.07±0.70 46.61±2.68 58.52±2.42 72 24.20±0.92 33.64±0.67 46.33±2.09 60.48±1.36 84 25.98±0.99 34.03±1.24 - -96 27.90±1.34 38.00±1.72 - -108 29.14±1.20 38.15±1.50 - -120 28.34±1.57 40.55±1.79 - -

表2 不同温度下家兔VH中Mg2+浓度检测结果 （±s，mmol/L）

表2 不同温度下家兔VH中Mg2+浓度检测结果 （±s，mmol/L）

注：“-”为缺失值

?

表3 固定效应的参数估计与比较

表4 三种固定效应的检验结果

由表3可知，K+、Mg2+浓度的处理效应 PMI和温度均具有统计学意义（P＜0.0001）。由表4可知，K+不同温度之间的区别有统计学意义（P＜0.000 1），PMI、PMI×T及 PMI×PMI的交互作用有统计学意义（P＜0.0001）；Mg2+不同温度之间的区别有统计学意义（P＜0.000 1），PMI×T、PMI×PMI的交互效应无意义，因此在模型拟合时未进行相应的交互拟合。经模型拟合后得到以PMI为自变量x，温度为自变量y，各离子浓度为因变量 f（x，y）的方程。 K+浓度的拟合方程为：

Mg2+浓度的拟合方程为：

2.3 验证组验证结果

将验证组温度和VH中K+、Mg2+浓度检测值分别带入相应方程内，计算PMI值、平均偏离时间和平均偏率（表5）。 PMI为 0～40h 时，K+、Mg2+浓度推断 PMI的偏离时间均在 10 h以内；PMI为 40～65 h时，K+、Mg2+浓度推断PMI的偏离时间在21h以内。

表5 混合效应模型拟合方程推断PMI的预测平均偏离率 （n=6）

3 讨 论

VH位于眼球后部的玻璃体内，玻璃体由于其特殊的解剖位置，与其他组织相对隔离，又受周围眼眶的保护，因此不易受到破坏，VH相对血液、脑脊液、心包积液、滑膜液等其他体液具有死后变化缓慢且规律性较强，在死亡早期以及后期均受污染较少等特点，因此一直是法医病理学用于PMI推断研究和死后化学物质分析的研究热点[8]。

VH中物质浓度的死后变化受多种内因及外因的影响，其中环境温度的影响最显著[9]。SCHONING等[10]研究发现，狗眼VH内K+浓度随温度的上升及PMI的延长而增加，钠、氯、尿素氮在4℃环境下的48 h内保持稳定，在20℃、37℃环境下难以稳定。MCLAUGHLIN 等[8]在 4℃、20℃、37℃温度条件下研究120头牛和120头猪血清和眼VH，发现K+和P的浓度随PMI延长和温度的上升而增加。王伟平等[11]检测家兔死后在不同的环境温度下VH胆碱酯酶和谷草转氨酶的失活情况，结果表明，两种酶的活性改变在一定时间内各出现一个平台期，平台期后两种酶的活性迅速下降，低温度组在死后54h后几乎为零，而在高温度组48h后就已经几乎为零。ZILG等[12]报道，尸体所在的环境温度对死后VH内K+浓度的影响占5%。ROGNUM等[13]证实，VH内K+、HX浓度推断PMI的拟合曲线随温度的增加其斜率增加。陶涛等[14]认为，Mg2+浓度随PMI的延长而升高。龚志强等[15]认为，48 h内Mg2+浓度与PMI相关性强，随PMI的延长而逐渐升高，可用于48h内的PMI推断。刘茜等[7]应用双眼交替微量取样法研究家兔VH内Mg2+浓度的变化，发现家兔死后眼VH中Mg2+浓度变化与时间呈强相关性，并随时间延长而升高。

以往运用VH中离子浓度变化推断PMI的研究[7，15-18]多考虑VH离子浓度死后变化和PMI两种变量，并在此基础上推导出线性回归方程、二元二次或多次方程，而未考虑外界环境温度的影响，因此在实际应用中有很大的局限性。混合效应模型，即所拟合的模型中既包含固定效应又包含随机效应，固定效应类似于标准回归系数，可直接估计得到，随机效应不是直接估计，而是来自方差和协方差估计。此模型可用于重复测量数据，即对同一个观察对象在不同时间点上进行的多次测量。由于重复测量数据是对同一对象的重复观测，同一受试者的观察数据间可能存在相关性，一些传统的统计学方法难以充分揭示这一内在特点。混合效应模型既考虑了观察对象在不同观察时间点的内在联系，又考虑了观察值间的内部相关性，其拟合方程更为可靠。本研究即对某一观察指标进行重复观察，以VH物质浓度为因变量，温度及PMI为固定效应进行模型拟合，所得结果证实，外界环境温度对物质的死后变化具有较大的影响作用，各温度组K+、Mg2+浓度随PMI延长均呈上升趋势，与以上各研究[7，15-18]保持一致性，但各个温度下的变化趋势明显不同，低温组变化平缓，而高温组变化剧烈，说明仅以物质的死后变化与PMI的关系，而不考虑外界环境温度的影响进行PMI推断，结果会存在相当大的误差。

本研究验证结果显示，K+、Mg2+浓度推断PMI的效果均较好，混合效应模型可应用于PMI的推断。在PMI为 0～40 h 时，K+、Mg2+浓度推断 PMI的偏离时间均在 10h 以内；当 PMI为 40～65h 时，K+、Mg2+浓度推断PMI的偏离时间在21h以内。由于本研究中高温度（25℃、35℃）腐败较快，取材仅持续到72h，虽最终不影响数据拟合的完成，但拟合精度会有所下降，对后期验证有一定的局限性，因此在联合温度进行分析时，应合理选取研究时限，同时缩短取样时间间隔，增加温度分组，获得更多数据，以提高拟合方程的精度。

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