动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测微生物抑制法的探讨

魏国美

（1.福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002；2.国家加工食品质量监督检验中心，福建 福州 350002）

β-内酰胺类抗生素是指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，是现有抗生素中使用最广泛的一类，其中包括青霉素及其衍生物、头孢菌素、单酰胺环类、碳青霉烯类和青霉烯类酶抑制剂等，由于其广谱、高效、低毒而在畜牧业中广泛使用。虽然?-内酰胺类药物本身没有很强的毒性，但会引起一些个体产生剧烈致命的过敏反应，以及破坏胃肠道菌群平衡和增强细菌耐药性等[1]，因此许多国家包括我国对动物使用这类药物和残留实行严格地监控管理，并提出残留的限量要求。

目前，对β-内酰胺类药物残留分析、检测的方法主要有仪器分析法、免疫分析法和微生物测定法[1]，其中微生物法具有样品前处理简便、检测时间短、不需要昂贵的仪器、可对大批量样品进行初筛等优点[2]。本研究对SN/T 2127-2008标准进行了部分优化和修改，现介绍如下：

1 实验部分

1.1 仪器

恒温箱、离心机、高速组织捣碎机、恒温水浴锅、涡旋振荡器和显微镜、游标卡尺。

1.2 材料及器皿

灭菌平皿（直径90 mm）、圆形滤纸片（直径10 mm，厚1.1 mm）、克氏瓶和可调移液器。

1.3 菌种

嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus ATCC10149。

1.4 培养基

1.4.1 胰蛋白胨大豆培养基

胰蛋白胨17.0 g，植物蛋白胨3.0 g，氯化钠5.0 g，磷酸氢二钾2.5 g，葡萄糖2.5 g，pH（7.3±0.2）。

1.4.1 细菌保存培养基

胰蛋白胨15.0 g，植物蛋白胨5.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1000 mL，pH（7.3±0.2）。

1.4.2 菌种芽孢培养基

胰蛋白胨17.0 g，植物蛋白胨3.0 g，氯化钠5.0 g，磷酸氢二钾2.5 g，蒸馏水1000 mL，琼脂20 g，pH（7.3±0.2）。

1.4.3 测定用培养基

牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，大豆蛋白胨0.3 g，葡萄糖5.25 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾0.25 g，吐温-80 1.0 g，溴甲酚紫0.06 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1000 mL，pH（7.8±0.2）。

1.5 试剂

1.5.1 pH6.0磷酸盐缓冲液

8.0 g磷酸二氢钾（KH2PO4）及2.0 g磷酸氢二钾（KH2PO4），用蒸馏水溶解并定容至1000 mL，121℃高压灭菌15 min。

1.5.2 磷酸盐—丙酮缓冲液

按体积比，pH6.0磷酸盐缓冲液∶丙酮=1∶1比例制备。

1.5.3 标准储备液

称取一定量的青霉素G标准品，用少量甲醇溶解后，再用灭菌pH6.0磷酸盐缓冲液溶解并定容至1000μg/mL，置2～8℃冰箱保存，贮存保质期7 d（德国Dr.Ehrenstorfer公司产品，有效期内使用）。

1.5.4 标准工作液

吸取一定量的各种标准储备液，用pH6.0磷酸盐缓冲液稀释成相应浓度的标准工作液，应当日配制使用。

1.6 测定步骤

1.6.1 样液提取

1.6.1.1 牛乳

取20 mL牛乳于50 mL离心管，3000 r/min离心5min，除去脂肪层，以1.0 mol/L盐酸液或1.0 mol/L氢氧化钠调节pH至6.5～7.0。脱脂奶可直接用于检测。

1.6.1.2 肉类、鱼和虾

称取10 g均质好的试样于50 mL离心管中，加入磷酸盐—丙酮缓冲液10 mL，30 min后，3000 r/min离心15 min，取上清液作为样液。

1.6.2 菌悬液的制备

嗜热脂肪芽孢杆菌菌悬液：一般情况下，菌种的传代次数不应超过5代，否则在每次使用前确证其生化特性没有发生变异，或另需购置新的标准菌株。在确定保存的菌种生化特性没有改变后，将菌种接在胰蛋白胨大豆培养基中55 ℃培养1~2 d后，取此菌液接种于装有芽孢培养基的克氏瓶中，（55±1）℃培养72 h，镜检芽孢数达80%以上（如果达不到，可再培养，芽孢数仍达不到要求，菌种可能变异，不可使用），用灭菌生理盐水洗下菌苔，混匀3000 r/min离心20 min弃去上清，加灭菌生理盐水洗涤，再离心，弃去上清后加灭菌生理盐水制成菌悬液，先用麦氏浊度计计数后用平板法计数以确定菌种的浓度。于2～8 ℃冰箱保存，贮存期30 d。

1.6.3 测定用平板的制备

将菌悬液按一定的比例加入到融化后冷却至60 ℃左右的灭菌检测用培养基中充分混匀后，使平板中的嗜热脂肪芽孢杆菌的浓度达到约2.0×106cfu/mL。先在灭菌平皿中入加检定培养基铺底层，待凝固后（约30 min）再加入6 mL混合液，保持水平待其凝固。取制备好的检定用平板2个，分别放置2个滤纸片，加入约80 μL（以纸片吸满为准）0.005 μg/mL，青霉素G标准工作液，冷藏放置30 min后，（63±1）℃培养4.5 h能产生直径为14 mm以上清晰、完整抑菌圈的平板为合格，达不到要求的平板应弃去。制备好的平板于2～8 ℃冰箱可保存2～3 d。

1.6.4 测定

取制备好的检定用平板2个，在平板底部作好标记，将滤纸片适当间隔置于平板上，每个平板最多不超过6个，在其中一个滤纸片加入约90μL（以纸片吸满为准）0.005 μg/mL，青霉素G标准工作液作为阳性对照，其余的滤纸片中加入约80 μL样液，冷藏放置30 min后，（63±1）℃培养4.5 h后开始观察，如果0.005 μg/mL青霉素G标准工作液产生清晰、完整的抑菌圈且直径大于14 mm时终止培养，记录标准工作液和样液的抑菌圈结果。每份样品做2个平板上的平行试验。

1.6.5 检测结果的判定

如果样液在平板上无抑菌圈，0.005 μg/mL青霉素G标准工作液的抑菌圈直径大于14 mm，即判定“阴性”。如果样液在平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径在13 mm以上，即判定为“初筛阳性”[3]。

2 讨论

上述方法在以下几点是对SN/T 2127-2008标准优化和补充

⑴ 在菌种的制备上明确先用胰蛋白胨大豆培养基复活增菌24~48 h后，取此菌液接种菌种芽孢培养基55 ℃培养2 d后37 ℃培养7 d，这样能增加产芽孢数。

⑵ 芽孢悬液制备时，洗下菌苔，制成悬液，先离心并洗涤2次，以去除培养基成份。

⑶ 确定芽孢悬液浓度时，先用麦氏浊度仪粗粗略测定悬液浓度，再平板精确计数这样就减少工作量并能准确获知悬液的菌浓度，也可用麦氏浊度仪测定后，在制测定平板前先试圈，方法为：取此菌悬液若干加入测定培养基中，制成几种含不同菌浓度的检定平板，后加0.005 ug/mL青霉素G，选择其抑菌圈直径大于14 mm且清晰的平板，该平板的菌浓度为正式试验的菌液添加量。

⑷ 检定平板中的嗜热脂肪芽孢杆菌的浓度达到2.0×106cfu/mL时比浓度为1.0×106cfu/mL更优，前者抑菌圈界线清晰，而后者界线模糊，不好观察测量。

⑸ 制检定平板时，先在皿底部铺一层检定培养基（约10 mL），后再在其上加含有菌液的检定培养基，否则会造成抑菌圈不规则难以测量，而且容易干裂，造成实验失败。

3 小结

β-内酰胺类药物残留的检测方法目前主要有微生物法、仪器分析法和免疫分析法等。液相色谱和气相色谱等方法比微生物法有更高的灵敏度和特异性，但是存在前处理繁琐、样品回收率不高，而且设备昂贵、操作要求高、分析费时的缺点。微生物法不需昂贵的仪器，易操作，适合于大量样品的筛选，是仪器分析、免疫分析等其它方法的有益补充，但它只能测定总量，不能进行定性，阳性样品须用其它方法进行确证。本研究通过对SN/T 2127-2008标准部分细节的修改和补充，使得该方法更具可操作性，实验的结果将更加理想。

参考文献：

[1]陈号,彭开松,朱良强,等.动物源食品中β-内酰胺类药物残留分析方法的研究进展[J].中国兽药杂志,2008,42(5)：42-45.

[2]吴谦,郑晶,黄晓蓉,等.动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测微生物抑制法的建立[J].福建畜牧兽医,2009,31(2)：19-22.

[3]国家认证认可监督管理委员会.进出口动物源性食品中β-内酰胺类药物残留检测 微生物抑制法：SN/T 2127-2008[S].北京：中国标准出版社,2008.