基于SRAP分子标记的23株大球盖菇遗传多样性和亲缘关系分析

朱静娴 李丽君 赵淑芳 陈宸 姜淑霞

摘要：利用相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）分子标记对国内外不同来源的23株大球盖菇菌株进行遗传多样性和亲缘关系分析，从288对引物中筛选出稳定性好、可重复性高、多态性稳定并能扩增出清晰明亮条带的38对引物。通过SRAP扩增图谱分析得出，以基因组DNA为模板的23株菌株扩增片段分子量在100～2 000 bp间，共扩增出322个位点，其中有205个多态性位点，多态位点比率为63.66%；供试菌株间的遗传相似系数为0.6646～0.9658；采用UPGMA法对扩增图谱进行聚类分析，在相似水平0.84时可将23株菌株分为3个类群，第Ⅰ类群为来自国外的2株菌株；第Ⅱ类群为本实验室驯化筛选的3株耐高温品种，第Ⅲ类群为国内不同地市的18株菌株。结果表明，不同大球盖菇菌株间存在明显遗传多样性，SRAP分子标记技术可将23株供试菌株鉴别开，且能分析出不同菌株间的亲缘关系。本研究可为大球盖菇菌株亲缘关系的鉴定及新品种选育提供理论依据。

关键词：大球盖菇；SRAP分子标记；遗传多样性；亲缘关系

中图分类号：S646.1+90.24文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）03-0022-07

Abstract Sequence-related amplified polymorphism （SRAP） molecular marker technique was used to study the genetic diversity and phylogenetic relationship among 23 Stropharia rugosoannulata strains collected from home and abroad. A total of 288 pairs of SRAP primers were tested， and 38 pairs could produce high-quality PCR production with good stability， repeatability and polymorphism. The analysis of SRAP amplification pattern showed that 322 bands were amplified from genomic DNA of 23 strains with the size of 100～2 000 bp， of which 205 bands were polymorphic and the percentage of polymorphic sites was 63.66%. The genetic similarity coefficient among the tested strains was ranged from 0.6646～0.9658. The cluster analysis proceeded by UPGMA method showed that 23 strains could be divided into three major groups at the similarity coefficient of 0.84. Group Ⅰ included two strains from abroad； Group Ⅱ included three high temperature resistant strains domesticated by our laboratory； Group Ⅲ were 18 strains cultivated or preserved in different cities in China. The results showed that significant genetic diversity existed among the strains. SRAP molecular marker technique could identify 23 strains clearly and analyze the phylogenetic relationship among different strains. This test provides the theoretical basis for the identification of Stropharia rugosoannulata phylogenetic relationship and new strain breeding.

Keywords Stropharia rugosoannulata； SRAP molecular marker； Genetic diversity； Phylogenetic relationship

大球盖菇（Stropharia rugosoannulata Farl. ex Murrill）别名皱环球盖菇、皱球盖菇、酒红球盖菇，属于担子菌门，层菌纲，伞菌目，球盖菇科，球盖菇属[1]。大球盖菇是优良的食、药用菌，其菇体大、色艳、质脆清香、营养丰富，有预防冠心病、助消化、缓解精神疲劳等多种保健价值，是国际菇类交易市场上的十大菇种之一，也是联合国粮农组织（FAO）向发展中国家推荐栽培的食用菌之一[2]。野生大球蓋菇于20世纪初在美国首次发现，并于1969年在德国人工驯化栽培成功，随后波兰、捷克斯洛伐克、匈牙利等国家相继引种栽培。我国大球盖菇野生资源主要分布于云南、西藏、四川、山西、新疆、辽宁、吉林等地[3]。20世纪80年代，上海市农业科学院食用菌研究所从波兰引进该菌种并在国内首次试栽成功，进而福建省三明真菌研究所对其栽培研究取得良好效益[4]。近年来，大球盖菇在福建、浙江、陕西、河北、辽宁、山东多省以各种栽培模式迅速发展，栽培前景十分广阔。

SRAP分子标记是一种基于PCR的新型标记系统，目前广泛应用于植物物种的遗传多样性和亲缘关系分析，相对于其他分子标记方法，SRAP分子标记在植物物种的遗传多样性和亲缘关系分析中能获得更多的信息[5-9]。该标记具有简便、稳定、高重复率、便于克隆目标片段的特点，并已被应用于图谱构建性状的标记和遗传多样性分析[10]。SRAP标记技术已在木耳、金针菇、灵芝、鸡腿菇、香菇、蘑菇属等食用菌上得到应用[11-16]。本研究采用SRAP分子标记，对收集到的国内外23株大球盖菇进行遗传多样性分析，明确其菌株间的亲缘关系，以期为大球盖菇菌株资源的保护和下一步育种工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

本试验所用的23株大球盖菇菌株均由山东省农业微生物重点实验室提供。具体菌株编号、名称、来源及产地见表1。

1.2 供试培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH值6.5。

1.3 耐高温大球盖菇菌株的获得及供试菌丝体制备

1.3.1 耐高温菌株的获得 将活化好的22株备选菌株（表2）置于25℃条件下培养5 d后转移至全自动培养箱中，程序设置为34℃和25℃交替循环，34℃持续8 h，25℃16 h，连续处理14个循环。剔除其中生长缓慢、畸形的菌株，将剩余菌株转接到新培养皿上，25℃培养5 d后，将程序设置为38℃ 6 h和25℃18 h，连续处理14个循环。再剔除表现不好的菌株，将程序设置为42℃ 4 h和25℃ 20 h，连续处理14个循环。选取其中生长速度较快、菌丝洁白粗壮的菌株作为耐高温备选株并通过继代培养进行耐高温稳定性验证。验证方法为：将筛选获得的耐高温备选株连续培养20代，分别取5、10、15、20代置于42℃条件下培养4 h，观察菌丝生长情况，获得耐高温性稳定的菌株作为耐高温菌株。

1.3.2 大球盖菇菌丝体制备 将23株大球盖菇菌株在PDA平板培养基上培养7～10 d后，转接到铺有玻璃纸的新鲜PDA平板培养基上，25℃恒温培养10 d后，分别刮取200 mg新鲜菌丝备用。

1.4 23株大球盖菇DNA提取、扩增和电泳检测

取200 mg新鲜菌丝放入研钵，倒入液氮迅速研磨成粉末，用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，经1.0%的琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像分析系统中拍照。以标准DNA分子量作对照，用紫外吸收法检测DNA浓度并稀释成50 ng/μL，贮存于-20℃冰箱中备用。

SRAP扩增反应体系：反应体积25 μL，其中2×Tap PCR Master Mix 12.5 μL，100 μmo1/L上、下游引物各1 μL，模板为50 ng/μL DNA 1 μL，用ddH2O补足体积。

SRAP扩增基准程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸1 min，5个循环；94℃变性1 min，50℃复性1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

取扩增产物7 μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，同时以DL 2000 DNA Marker作为分子量标准，100 V恒压电泳40～60 min，通过紫外凝胶成像系统观察并拍照。

1.5 SRAP引物及反应条件筛选

采用Li等[17]2001年发表的引物，由铂尚生物技术（上海）有限公司合成（表3）。正向引物16条，反向引物18条，采用Me-Em的组合表示方式共得到288对引物。选用3株大球盖菇DNA对288对引物进行初步筛选，将重复性好、强度较高、清晰可辨无争议、能体现菌株间差异的条带确认为标记条带，进行相应的统计和分析以筛选出最佳组合引物。

SRAP-PCR反应体系退火温度的优化：选用编号为1、5和14菌株的DNA作为模板，用2对引物（Me5、Em4和Me7、Em9）进行扩增，对退火温度进行筛选，温度设置为32、32.1、32.4、32.8、33.2、33.7、34.2、34.7、35.2℃、35.6、35.9、36℃。温度确定后另选3株大球盖菇DNA模板对SRAP-PCR体系进行验证。

1.6 SRAP电泳结果统计及处理分析

将相同引物 PCR 扩增产物中电泳迁移率一致的标记条带确认为同一条带，扩增阳性记录为“ 1”，扩增阴性记录为“ 0”，把图形资料转换成数据资料，统计形成“ 0/1”表型数据矩阵，根据该数据矩阵统计算出多态性位点数、扩增位点数和多态位点比率 P（Percentage of polymorphic sites），估算遗传分化的水平。

计算公式：P=k/n×100%。

式中P为多态位点比率，k为多态性位点数，n为扩增位点数。

利用POPGENE 1.32软件计算各菌株间的Neis遗传相似系数（GS）、遗传距离（GD）、Neis遗传多样性指数（H）和Shannon信息指数（I），并利用NTSYS-PC软件进行菌株间的非加权组平均法（UPGMA）聚类分析，生成遗传距离聚类图。

2 结果与分析

2.1 SRAP引物筛選及其扩增结果分析

288对引物中共筛选出38对重复性好、多态性比率高的引物。利用38对引物对23株大球盖菇基因组DNA进行SRAP扩增并电泳检测，共扩增出322个位点，其条带分子量大小在100～2 000 bp之间。其中多态性位点205个，多态位点比率为63.66%。38对引物扩增的位点数从4～12个不等，平均每对引物扩增出8.47个位点，平均多态性位点数为5.39个（表4）。引物Me5-Em1对23株大球盖菇菌株的SRAP图谱见图1。

基于23株供试菌株的SRAP扩增多态性，利用POPGENE 1.32软件对试验数据进行各项参数的统计分析。结果表明，样品间的平均Neis遗传多样性指数为0.1616，平均Shannon指数为0.2577，说明供试菌株间的遗传多样性较高，遗传差异性较大。

2.2 聚类分析

由图2可以看出23株大球盖菇菌株两两间的相似性系数范围为0.6646～0.9658。菌株编号6与7的相似性系数为0.9658，亲缘关系最近，菌株编号2与19的相似性系数为0.6646，亲缘关系最远。

从图3可以看出，23株供试菌株均可以鉴别开。当遗传相似系数为0.84时，23株大球盖菇供试菌株被分为3个类群：第Ⅰ类群为来源于国外的编号为1号和2号的菌株；第Ⅱ类群为本实验室耐高温驯化后筛选的3株菌株（菌株编号为18、19和20）；第Ⅲ类为来自国内13个不同地市的18株菌株。其中，第Ⅱ类群的3株菌株之间的亲缘关系与其原发菌株（菌株编号为15、16和17）之间的亲缘关系相似，即原发菌株16和17聚在一支，与15较远，耐高温菌株中的19和20同样聚在一起，与18较远；第Ⅲ类群中，源自云南子实体颜色为黄色的菌株（菌株编号为21、22、23）聚在一起，来自山东济宁的4株菌株（菌株编号为14、15、16、17）聚在一起；黑龙江（菌株编号为9、13）、辽宁（菌株编号为5、8、10）、山东济南（菌株编号为6）、山东临沂（菌株编号为4）、山东泰安（菌株编号为7）的菌株与三明真菌研究所保存的菌种（菌株编号为11）遗传距离较近。

结果表明：（1）本试验中多个地理位置相距较近的菌株聚在一进化支上，说明供试菌株间的遗传相似性与它们的地理位置有一定的相关性；部分地理位置与气候条件相差较大的栽培菌株也有聚在一个进化支上，说明多个大球盖菇品种有互相交流或引种异地栽培状况。（2）3株耐高温菌株间的相似性系数较高，与驯化前的3株原发菌株有一定的差异，说明长期在高温条件下培养的菌株，为了适应高温环境，部分基因发生了相应变异。但从它们的遗传相似性与其他菌株相比较仍然较高，其亲缘关系明显近于其他菌株，说明SRAP分子标记技术能高效鉴别大球盖菇菌株。（3）黄色菌株之间亲缘关系较近，虽然同样聚在第Ⅲ类群但是与国内其他菌株亲缘关系较远，说明表型颜色不同的品种在基因上也有一定差异。

为进一步明确大球盖菇菌株遗传多样性与其地理来源的关系，将20株（菌株编号为18、19、20除外）大球盖菇按照其地理来源分为8个群体。采用POPGENE 1.32软件计算不同地理来源的大球盖菇群体间遗传相似性系数Neis和遗传距离（表5）。由表5可以看出：8个群体的遗传相似性系数为0.7422～0.9584，其中辽宁群体和黑龙江群体相似性系数最高，为0.9584，说明其亲缘关系最近。而四川和大阪两个群体间的相似性系数最小为0.7422，可能由其地理位置相隔较远，生境差别较大，对基因交流产生了一定的障碍，因而相似性系数较小。根据群体间遗传相似性系数，运用POPGENE软件进行聚类（图4）。由图4可以看出辽宁地区和黑龙江地区的菌株亲缘关系最近，其次为山东地区，这些居群间的地理位置接近，气候条件类似，在长期自然选择条件下，基因保持著较小的遗传距离。

3 讨论与结论

SRAP技术现目前广泛应用于食用菌的菌株分子鉴定、分类学研究、遗传多样性及亲缘关系分析等方面。许晓燕等[18]应用SRAP和AFLP标记对19株毛木耳进行了遗传多样性分析；Sun等[19]采用SRAP标记对31个灵芝商业栽培品种和野生菌种进行了分类学及遗传多样性研究；卢政辉等[20]通过SRAP技术对不同地区的24个秀珍菇进行了DNA指纹分析，获得了它们的亲缘关系；蔡志欣等[21]利用SRAP技术对32个茯苓菌株进行了DNA指纹分析，找出了各菌株间的亲缘关系，分析得到供试菌株间的遗传背景，这均为食用菌遗传学研究和育种提供了依据。

由于从菌丝及子实体形态上区分不同大球盖菇品种比较困难，本研究通过SRAP技术成功对23株大球盖菇菌株进行鉴别，菌株间聚类分析结果表明，在不同遗传相似系数水平上，供试菌株可分为多个亚群；不同亚群表明菌株间亲缘关系与地理来源、耐高温驯化和不同的表型有关，体现了大球盖菇种内遗传多样性丰富；国内20株供试菌株被全部区分开，表明该技术可用于大球盖菇不同菌株的遗传背景分析，适用于亲缘关系鉴定。本研究选用的供试大球盖菇菌株包含国家认证品种、国内大部分主要栽培品种、黄色变异菌株以及耐高温菌株，反映出菌株间亲缘关系的整体情况，同时为品种分类鉴定和遗传育种的亲本选择提供了理论依据。

参 考 文 献：

[1] Hawksworth D L. The fungal dimension of biodiversity： magnitude， significance， and conservation[J]. Mycological Research， 1991， 95（6）：641-655.

[2] 黄年来. 大球盖菇的分类地位和特征特性[J]. 食用菌， 1995（6）：11.

[3] 佘冬芳， 樊卫国， 徐彦军，等. 大球盖菇栽培技术研究进展[J]. 种子， 2007， 26（1）：84-87.

[4] 萨仁图雅， 图力古尔. 大球盖菇研究进展[J]. 食用菌学报， 2005， 12（4）：57-64.

[5] 孙宇龙， 侯北伟， 耿丽霞，等. 基于SRAP标记的白芨遗传多样性和遗传结构评价[J]. 药学学报， 2016，51（1）：147-152.

[6] 刘昆玉， 徐丰， 石雪晖，等. 基于SRAP标记的刺葡萄亲缘关系分析[J]. 湖南农业大学学报（自科科学版）， 2012， 38（6）：607-611.

[7] 唐源江， 曹雯静， 吴坤林. 基于SRAP标记的国兰种质资源遗传多样性分析及分子身份证构建[J]. 中国农业科学， 2015， 48（9）：1795-1806.

[8] 李立新， 杨途熙，魏安智，等. 基于SRAP标记的花椒种质资源遗传多样性及群体结构分析[J]. 华北农学报， 2016， 31（5）：122-128.

[9] 廖柏勇， 王芳， 陈丽君，等. 基于SRAP分子标记的苦楝种质资源遗传多样性分析[J]. 林业科学， 2016， 52（4）：48-58.

[10]徐操， 赵宝华. SRAP分子标记的研究进展及其应用[J]. 生命科学仪器， 2009， 7（4）：24-27.

[11]刘华晶， 许修宏， 姜廷波. 大兴安岭地区野生黑木耳菌株SRAP的遗传多样性分析[J]. 中国农业科学， 2011， 44（13）：2641-2649.

[12]陈美元， 廖剑华， 李洪荣，等. 双孢蘑菇栽培菌株遗传多样性的DNA指纹分析[J]. 中国农学通报， 2009， 25（4）：149-156.

[13]贾定洪， 王波， 彭卫红. 23个金针菇菌株的SRAP分析[J]. 西南农业学报， 2011， 24（5）：1871-1874.

[14]张红玉， 付立忠， 吴学谦，等. 灵芝原生质体融合子的SRAP分子标记鉴定[J]. 食用菌学报， 2009， 16（4）：5-9.

[15]王守现， 刘宇， 耿小丽，等. 应用SRAP标记对六个鸡腿菇菌株的多态性分析[J]. 江西农业大学学报， 2006， 28（5）：753-757.

[16]刘俊， 马超君， 向星洁，等. 基于SRAP标记构建野生香菇核心种质库[J]. 食用菌学报， 2017， 24（1）：7-17.

[17] Li G， Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP）， a new marker system based on a simple PCR reaction： its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theoretical & Applied Genetics， 2001， 103（2/3）：455-461.

[18]許晓燕， 余梦瑶， 罗霞，等. 利用AFLP和SRAP标记分析19株毛木耳的遗传多样性[J]. 西南农业学报， 2008， 21（1）： 121-124.

[19] Sun S J， Gao W， Lin S Q， et al. Analysis of genetic diversity in ganoderma population with a novel molecular maker SRAP[J]. Appl. Microbiol. Biotechnol.， 2006，72：537-543.

[20]卢政辉. 秀珍菇及其近缘22株菌株的SRAP分析[J]. 江西农业学报， 2008， 20（11）：8-10.

[21]蔡志欣， 蔡丹凤， 陈美元，等. 32个茯苓菌株的SRAP分析[J]. 食药用菌， 2013（2）：96-98.