甜樱桃MYB转录因子基因的克隆与表达分析

魏海蓉 宗晓娟 朱东姿 谭钺 徐丽 陈新 王甲威 刘庆忠

摘要：本研究利用转录组测序结果，通过RT-PCR从甜樱桃品种‘美早果实中克隆出1个MYB转录因子基因，将其命名为PaMYB10，GenBank登录号为ALH21137.1。该基因编码的氨基酸序列具有R2和R3保守结构域，属于R2R3-MYB家族基因，与蔷薇科的桃、欧李、梅等作物亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明，PaMYB10在红色品种‘美早的茎、叶、花和果实中均有表达，但表达量存在差异，在成熟果实中表达量最高。‘美早中花青苷含量随着果实的发育逐渐升高，PaMYB10的表达显著上调；‘13-33中花青苷含量随着果实的发育变化不明显，基因表达量变化也不明显。在果实发育后期，‘美早果实中花青苷含量和PaMYB10的表达量均显著高于‘13-33。推測PaMYB10的高水平表达可能与红色甜樱桃果实花青苷积累有关。

关键词：甜樱桃；花青苷；转录因子；MYB；基因表达

中图分类号：S662.5：Q781文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）03-0006-05

Abstract Based on our previous transcriptome data of sweet cherry fruit， the MYB transcription factor gene was cloned using RT-PCR method from sweet cherry cultivar ‘Tieton， and named PaMYB10. The sequence was submitted to GenBank with the accession number of ALH21137.1. Sequence analysis revealed that the deduced amino acid of PaMYB10 contained R2 and R3 conserved domain and it was a typical R2R3-MYB family gene. The encoded protein PaMYB10 had the closest genetic relationship with Prunus persica， Prunus domestica and Prunus mume. The result of qRT-PCR showed that PaMYB10 was expressed in stem， young leaf， flower and fruit tissues in red cultivar ‘Tieton， but the expression quantity was different. The expression quantity of PaMYB10 was the highest in the mature fruit of ‘Tieton. The content of anthocyanin in ‘Tieton increased gradually and the expression level of PaMYB10 showed significantly up-regulated along with the fruit development. However， the content of anthocyanin and expression level of PaMYB10 in the yellow cultivar ‘13-33 were almost unchanged and remained at a very low level during fruit ripening. In the later stage of fruit development， the content of anthocyanin and expression level of PaMYB10 in the red cultivar ‘Tieton were significantly higher than those of the yellow cultivar ‘13-33. It is speculated that the high level expression of PaMYB10 may associated with the anthocyanin accumulation in red sweet cherry fruit.

Keywords Sweet cherry； Anthocyanin； Transcription factor； MYB； Gene expression

在甜樱桃果实中，花青苷的合成和积累是果皮呈现红色的主要因素[1，2]。对甜樱桃果实花青苷合成相关基因进行克隆与表达分析，阐明甜樱桃果实着色和花青苷代谢调控机理对改良果实品质具有重要理论意义。

MYB是植物花青苷生物合成途径中的重要调节因子，其与bHLH和WD40转录因子结合形成MYB-bHLH-WD40三元复合体调控结构基因的表达[3]。矮牵牛R2R3-MYB 基因MYB27与bHLH 转录因子基因AN1和花青苷合成结构基因互作调控花青苷的代谢[4]。与花青素合成相关的MYB转录因子绝大多数为R2R3型，其主要调控花青素合成途径中上游结构基因的表达，MYB-bHLH-WD40复合体调控下游结构基因的表达[5]。目前已在多种果树中鉴定出大量参与花青苷合成的MYB基因，如苹果中的MdMYB1、MdMYB10和MdMYBA等在苹果果实花青苷合成过程中起重要调节作用[6-8]。欧洲红色葡萄品种中VvMYBA1调控UFGT表达，促进葡萄花色苷生物合成，而在绿色品种中不表达[9，10]。MYB转录因子对花青苷的生物合成不仅具有正调控作用，还具有负调控作用，如在草莓中，FaMYB1抑制花青素的合成，而FaMYB10则促进花青素的积累[11，12]。另外，在许多植物中，单个R2R3-MYB转录因子的上调即可激活多个结构基因的表达，从而促进花青苷的积累[13，14]。目前关于甜樱桃MYB与果实花青苷积累的响应及调控机制报道较少[15]。

笔者课题组从前期的甜樱桃果实转录组和数字表达谱数据的差异表达基因中检测到一批与花青苷合成相关的候选MYB基因。本研究在前期研究的基础上，克隆了一个甜樱桃MYB转录因子基因，进一步结合RT-PCR技术对其在不同组织、不同色泽品种的不同发育阶段果实中的表达模式进行研究，探讨其与花青苷合成及果实色泽之间的关系。为进一步验证基因功能和深入挖掘后续基因奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验采用红色甜樱桃品种‘美早（Prunus avium L. Tieton）和纯黄色品种‘13-33（P. avium L.13-33）为试材。试验于2014—2015年在山东省果树研究所完成。随机采集正常发育的幼叶、茎和花组织，立即用液氮速冻，用于RNA提取；分别采集花后20、35、45 d和55 d 4个发育阶段正常发育的果实，从果实表面切取1～2 mm厚果肉（包含果皮），分别用锡纸包好，立即用液氮速冻，存于-80℃冰箱中用于提取RNA和花青苷含量测定。不同组织和不同发育阶段果实样品分别取3次重复。

1.2 总RNA的提取与cDNA合成

采用CTAB法提取甜樱桃果实及其它组织总RNA[16]。总RNA质量分别采用琼脂糖凝胶电泳、NanoPhotometer 超微量蛋白質核酸检测仪（IMPLEN， Westlake Village， CA， USA）进行检测。利用Thermo反转录试剂盒，以Oligo（dT）18为引物反转录合成第一链cDNA，具体操作参照试剂盒说明书进行。

1.3 目的基因克隆

根据作者前期完成的转录组测序数据库信息（NCBI注册号：SRP044388）[17]，获得1条编码MYB转录因子的unigene（comp26801_c1）。通过NCBI BLAST比对发现，其具有完整的ORF。根据unigene ORF序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计特异性引物（表1），以甜樱桃品种‘美早成熟果实的cDNA为模板，扩增基因序列。反应体系为：PCR Mix 12.5 μL，cDNA模板1.0 μL，F引物（10 μmol/L）1.0 μL、R引物（10 μmol/L）1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，53℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35个循环；72℃延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的条带，连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，并筛选阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，验证全长序列的准确性。

1.4 序列分析和同源性比较

采用NCBI在线ORF Finder （http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html） 寻找开放阅读框（ORF）；利用NCBI BLAST （ http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov） 进行核苷酸及氨基酸序列的同源序列搜索；挑选有代表性物种序列，采用DNAMAN 软件进行多序列比对及系统进化树的构建。利用在线的ExPASY ProtParam Tool （http：//us.expasy.org/tools/ProtParam.html） 预测编码蛋白的理化特性；通过ProtScale 软件（http：//www.expasy.org/cgibin/protscale.pI） 进行疏水性/亲水性分析。

1.5 基因表达分析

分别采用‘美早和‘13-33花后20、35、45 d和55 d 4个不同发育阶段果实以及幼叶、茎和花的cDNA为模板，采用甜樱桃β-ACTIN为内参基因，按照荧光定量PCR的要求使用Beacon Designer 8 软件进行引物设计（表1）。对cDNA模板稀释20倍后，荧光定量PCR采用SYBRGreen PCR Master Mix（含ROX）在ABI PRISM7500 Fast 实时荧光定量RT-PCR仪上完成。PCR反应体系：SYBRGreen PCR Master Mix（With ROX）10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，cDNA 1 μL，RNase-Free H2O 8.2 μL。PCR反应程序：预变性 95℃ 10 min；变性95℃ 15 s，退火/延伸55℃ 1 min，40个循环；每个样品3次重复。按照仪器默认添加熔解曲线分析 95℃ 15 s，55℃ 1 min，95℃ 15 s，55℃ 15 s，以验证反应的特异性。扩增曲线和样品Ct值由仪器自带软件自动生成。基因表达量的计算采用2-ΔΔCT方法进行。采用SPSS version 16.0进行差异显著性分析（P<0.05）。

1.6 花青苷含量测定

甜樱桃花青苷含量的测定参照王慧聪等[18]的方法。精确称取鲜样0.5 g，加液氮研磨后，准确加入甲醇∶0.1%甲酸水（2∶8，V/V）提取液15 mL，超声波振荡10 min后，放入4℃冰箱浸提24 h。12 000 r/min离心15 min，收集上清液。测定提取液在553 nm和600 nm 处的吸光值，两者之差即为花青苷的相对含量。差值每增加0.01定义为一个单位U。

2 结果与分析

2.1 PaMYB10的克隆及序列分析

通过对前期完成的甜樱桃果实转录组数据进行分析，从差异表达基因中筛选出编码MYB转录因子的unigene（comp26801_c1）序列。通过NCBI BLAST比对发现，该序列具有完整的ORF。根据unigene序列设计特异性引物（表1），以甜樱桃品种‘美早果实的cDNA为模板进行扩增，获得约950 bp 的片段（图1）。测序结果表明，目的片段为935 bp。根据ORF同源性将其命名为PaMYB10（GenBank登录号：ALH21137.1）。利用NCBI 中的ORF Finder 分析发现，PaMYB10的cDNA序列含有672 bp的ORF，编码223个氨基酸，与转录组数据中unigene的相应序列完全一致。ProtParam 软件分析显示，PaMYB10蛋白的预测分子量为25.83，为碱性氨基酸。不稳定系数为56.17，属于不稳定蛋白。亲水性平均数为-0.818，预测该蛋白为亲水性蛋白。

2.2 PaMYB10的同源性及進化分析

通过在线网站CDD 预测蛋白保守结构域，结果表明，PaMYB10具有R2和R3两个MYB保守结构域（图2），该结构域是R2R3型MYB家族基因所特有的。PaMYB10与其它R2R3-MYB家族成员在此区域高度保守。BLAST分析结果表明， PaMYB10与其它物种相应蛋白的同源性较高。系统进化分析结果（图3）显示，PaMYB10与蔷薇科的桃和欧李聚为一类，其氨基酸序列一致性均达到84%以上，与蔷薇科的梅等物种的亲缘关系次之，其氨基酸序列一致性也达到了70%以上，而与葡萄、猕猴桃等物种亲缘关系较远。

2.3 PaMYB10在不同组织中的表达特性分析

以β-ACTIN基因为内参，采用qRT-PCR方法对PaMYB10在甜樱桃品种‘美早不同组织中的表达特性进行了分析。结果（图4）表明：PaMYB10在茎、幼叶、花、幼果和成熟果实中均有表达，但表达量存在差异，说明这些基因的表达具有一定的组织特异性。PaMYB10在成熟果实中表达量显著高于茎、幼叶、花和幼果。

2.4 不同色泽甜樱桃果实发育期间花青苷含量变化与PaMYB10表达的关系

为了进一步分析甜樱桃果实花青苷积累与PaMYB10的关系，测定了不同色泽甜樱桃果实发育期间花青苷含量的变化以及PaMYB10的表达。如图5所示，随着果实的发育，红色品种‘美早果实中的花青苷含量逐渐升高，特别是在转色期（花后35 d）后迅速升高，由绿果期（花后20 d）的0.67 U/g FW上升至完熟期（花后55 d）的 197.4 U/g FW，升高了293.6倍。然而，黄色品种‘13-33整个果实发育期间，花青苷含量变化不明显，且一直保持在极低含量水平。qRT-PCR检测结果表明，PaMYB10在红色品种‘美早的果实发育期间的表达量逐渐升高，但在黄色品种‘13-33中的表达量极低，并且随着果实的发育变化不明显。从转色期到完熟期，PaMYB10基因在红色品种‘美早果实中的表达量均显著高于黄色‘13-33果实。以上结果表明，甜樱桃果实中花青苷的生物合成和积累可能与PaMYB10的高表达有关。

3 讨论与结论

MYB蛋白是植物转录因子中最大的家族之一，调控着植物代谢的多个途径，如生长发育、次生代谢和抗病等途径[19]。根据MYB转录因子蛋白包含保守的DNA结合区域（MYB结构域）的个数，可以把MYB蛋白分为三类：R1-MYB、R2R3-MYB和R3-MYB[20]。参与调控花青苷生物合成的MYB转录因子绝大多数为R2R3-MYB[4]。本试验在前期转录组测序的基础上从甜樱桃品种‘美早果实中克隆出PaMYB10转录因子基因。PaMYB10属于R2R3-MYB家族，具有R2和R3保守结构域，并且与其它物种R2R3-MYB家族成员在此区域高度保守。这与调控花青苷生物合成的其它R2R3-MYB转录因子结构相似。多序列比对和系统进化分析表明，PaMYB10与蔷薇科的桃、欧李、梅等作物亲缘关系较近。

在草莓[12]、葡萄[10]、桃[21]和苹果[22]等果树中，R2R3-MYB转录因子在花青苷合成过程中起到关键调控作用。苹果MdMYB10参与苹果叶片、果肉中花青苷生物合成的调控[6，22]。与苹果MdMYB10直系同源的MYB转录因子在其它蔷薇科物种中也得到鉴定，这些MYB转录因子均与果实花青苷生物合成有关[23，24]。Shen等从樱桃中克隆得到的pacMYBA在成熟果实的果皮中表达量最高，在花青苷合成过程中起正调控作用[25]。本试验中，红色品种‘美早果实颜色在由绿色转变为深红色的过程中，花青苷含量由绿果期的0.67 U/g FW上升至完熟期（深红色）的 197.4 U/g FW。然而，黄色品种‘13-33果实颜色在由绿色转变为黄色的过程中，花青苷含量变化不明显，并且一直保持在极低含量水平。由此说明，甜樱桃果实花青苷的积累是果实红色形成的主要因素之一。从基因表达特性看，‘美早果实中PaMYB10的表达量随着果实的发育逐渐升高，在‘13-33果实发育过程中变化不明显。在果实发育后期，‘美早果实中PaMYB10的表达量显著高于‘13-33。通过对红色品种‘美早不同组织的表达分析发现，PaMYB10的表达具有组织特异性，在成熟果实中表达量显著高于幼果。综合以上结果说明，PaMYB10的高水平表达可能与红色甜樱桃果实花青苷的积累有关。

参 考 文 献：

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