CRISPR/Cas9系统介导的植物基因组编辑及其应用

王红霞 张一卉 李景娟 贺立龙 高建伟

摘要：CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）系统是在细菌和古细菌中发现的一种抵抗病毒及质粒入侵的获得性免疫系统。该系统由sgRNA（single guide RNA） 及Cas9核酸酶组成，具有可操作性及效率高的优点，已被成功运用于多种植物基因组编辑，如小麦、水稻、玉米等。本文简要阐述了CRISPR/Cas9系统的发现、分类、结构及作用机制，重点综述了CRISPR/Cas9系统在植物方面的研究进展及前景，以期为利用基因组编辑技术改良农作物的产量、品质、抗病性等重要农艺性状提供参考。

关键词：CRISPR/Cas9；植物；基因组编辑

中图分类号：S336：Q78文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）02-0143-08

Abstract CRISPR/Cas9 （clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9） is an acquired immune system of bacteria and archaea， which can protect against virus and plasmid invasions. The system consists of sgRNA （single guide RNA） and Cas9 nuclease， which has advantages of maneuverability and high efficiency. It has been successfully applied to genome editing in a variety of plant species， such as wheat， rice， maize， etc. In this article， we briefly described the discovery， classification， structure and mechanism of CRISPR/Cas9 system， and focused on the research progress， development and prospect of CRISPR / Cas9 system application in plants， which would help us to improve crop plants in important agronomic traits such as yield， quality and disease resistance by genome editing technology.

Keywords CRISPR/Cas9； Plant； Genome editing

精準编辑基因组对植物重要基因功能研究、农作物遗传育种具有重要推动作用。许多研究者利用各种核酸内切酶如“基因组剪刀”编辑植物基因组，产生功能缺失突变体或对感兴趣的位点进行定点修饰，研究相关基因的功能及其作用机制。

锌指核酸酶（zinc-finger nuclease， ZFN）和类转录激活因子效应物（transcription activa-tor-like effector， TALEN） 是20世纪人类发现的基因组编辑工具，它们不仅被成功应用于植物基因组改造，并有望改革传统植物育种及基因组修饰。在ZFNs和TALENs基因组编辑系统中，首先，DNA结合蛋白和核酸内切酶FokⅠ融合形成人工核酸内切酶[1，2]，而人工核酸内切酶识别并切割特异DNA序列造成DSBs（double-strand breaks），最后通过非同源末端连接或同源重组的方式实现基因组碱基插入、删除或突变[3]（图1）。ZFNs和TALENs是两种有效的基因组编辑工具，但是也有其自身无法克服的缺点。在ZFNs应用中，大分子蛋白的设计与构建既昂贵又费时费力，因此ZFNs的应用在许多植物中受到限制[4]。而在TALENs应用中，基因组编辑的脱靶率高、稳定性差[5]。因此，寻找一种简单、高效、稳定且成本低的基因组编辑技术迫在眉睫。2013年，CRISPR/Cas9技术由于能够高效快捷地编辑目标基因组且成本较低，被Science杂志评为年度十大科学进展之一。该系统由RNA引导并由Cas9行使剪切功能。与ZFNs和TALENs技术相比，CRISPR/Cas9系统不需要设计蛋白，只需改变gRNA（guide RNA）序列中20 nt特殊片段。CRISPR/Cas9技术已被成功运用于许多植物的基因组编辑中[6]。本文将简要介绍CRISPR/Cas9系统的发现、结构及作用机制，重点介绍其在植物农作物方面的最新研究进展。

1 CRISPR/Cas9 系统

1.1 CRISPR/Cas9 系统的发现

1987年，日本科学家在大肠杆菌基因组研究中发现一段特殊串联间隔重复序列（图2），但功能未知[8]。2002年，Jansen等[9]将该序列结构正式命名为成簇规律性间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeat， CRISPR）。在研究初期，由于缺乏病毒及外源质粒序列信息，CRISPR行使的确切功能并未阐明，但随着测序技术及生物信息学的发展，有研究小组发现细菌CRISPR序列中的间隔序列与细菌病毒的遗传物质具有高度同源性[10-12]，因此，科学家推测该序列可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵有关。根据这一假设， Barrangou[13]和Marraffini[14，15]等的研究先后发现并证明CRISPR系统可以帮助细菌抵抗外源噬菌体入侵并阻止外源质粒转移，也首次通过试验验证了CRISPR系统的功能。这一系列研究表明，CRISPR/Cas9作为全新的细菌获得性免疫系统，已经成为当前生命科学领域中最为炙手可热的技术之一。

1.2 CRISPR系统的分类

细菌和古细菌在长期进化中形成了复杂的CRISPR适应性免疫系统，其根据Cas蛋白及其序列的不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型（表1）。本文将主要介绍CRISPRⅡ型系统，由于它不需要依赖复杂的蛋白复合物且极易操作，目前已广泛应用于各植物基因组编辑中。

1.3 CRISPR/Cas9 系统的结构及其作用机制

CRISPR/Cas9 系统是目前应用最为广泛的系统，它首次被发现于产脓链球菌（Streptococcus pyogenes SF370）[19]。其基因座主要包括三部分根据干扰靶标不同分为TypeⅢA和TypeⅢB两种类型，前者靶标是mRNA[17]，后者是DNA[14]。主要参与crRNA的成熟和剪切外源入侵DNA[18]。

（图3a）：5′端是编码tracrRNA（transactivating CRISPR RNA）的基因，其转录产物可以与CRISPR RNA（crRNA）互补结合，指导Cas9行使功能；中间为编码Cas蛋白的相关基因，用于剪辑外源DNA；3′端由多个高度重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）形成的R-S结构及其前导序列组成。细菌首先需要采集外源入侵短片段DNA（30～50 bp），其作为前间隔序列（protospacer）被插入到CRISPR位点，由重复序列隔开，形成“记忆”。当细菌再次遭到类似外源DNA入侵时，CRISPR基因座表达，转录形成接近40 nt的前体crRNA，然后借助RNA酶Ⅲ促使crRNA成熟并与tracrRNA通过碱基互补配对形成gRNA （guide RNA），激活并诱导Cas9蛋白催化DNA剪切[13]。Cas9蛋白是具有HNH及RuvC核酸酶活性结构域的功能蛋白，其功能域分别负责剪切与CRISPR互补的目标DNA链及非互补链，使双链断裂[19]。Cas9蛋白主要识别靠近20 bp目标序列3′末端的较为保守的共有序列，该共有序列被称为PAM序列（protospacer adjacent motif），通常为“NGG”[19，20]，但也有研究发现Cas9在极少情况下也可识别“NAG”序列[21]。

随着该系统作用机制日趋明朗，研究者设计在体外组装crRNA与tracrRNA杂交形成嵌合RNA分子， 指导Cas9蛋白切割目的基因， 形成 DSBs（double strand breaks，图3b）。科学家已经证明该嵌合RNA分子（sgRNA）不但在体外具有功能，并可使目标序列双链断裂。该项技术在许多实验室已逐步趋向成熟。

（a）细菌typeⅡCRISPR/Cas9系统：trans-activating crRNA （tracrRNA）与pre-crRNA重复区域互补配对并经RNaseⅢ切割，形成成熟crRNA。Cas9在成熟crRNA引导下通过间隔序列识别目标序列，诱导双链断裂，抵御外源DNA侵入。（b）嵌合RNA（sgRNA）分子形成。

體外组建crRNA和tracrRNA形成一条单链gRNA （guide RNA），导入并编辑目标基因组位点。

2 CRISPR/Cas9 系统最新研究进展

2.1 载体系统

CRISPR/Cas9系统的发现使植物基因组编辑更加方便快捷，但多项试验证明其编辑效率相对较低[23，24]。因此，各种CRISPR/Cas9载体系统应运而生，包括基因敲除、敲进，基因组缺失、破坏等等，这些载体系统的成功构建大大提高了植物基因组编辑效率。

2014年，Nishimasu等[25]构建了一个含有98个核苷酸（包括20 nt目标序列）的典型sgRNA，它能够指导Cas9/sgRNA复合物行使功能。sgRNA的表达通常由核内小RNA基因启动子U3和U6所驱动，许多研究者通常用带有目标序列的U3/U6-启动子-sgRNA表达组件来行使功能[23]。2015年，Xie等[26]通过在sgRNA两侧添加多顺反子RNA的前导序列构建了sgRNA载体系统。许多研究证明，经过密码子最优化Cas9基因（Cas9p）也能够提高植物基因组编辑效率[23，24，27]。Ma等[28]进一步通过提高Cas9p 5′末端的G/C含量使编辑效率更大提升。在早期研究中，为了使sgRNA和Cas9表达组件能够协调而易于进入植物组织细胞，人们通常用一个瞬时表达系统直接将载有sgRNA和Cas9表达组件的质粒导入原生质体中，但这很难获得可遗传的目标基因突变的转基因植株[29]。于是，Shan等[24]通过基因枪法将完整的Cas9和sgRNA表达结构击入愈伤组织和未成熟的胚，从而使植物产生了可遗传突变。Svitashev等[30]也用同样方法在体外诱导了目标基因突变。此外，有研究发现通过农杆菌渗入法将带有sgRNA表达组件的烟草花叶病毒DNA导入经Cas9转化的烟草中能够使CRISPR/Cas9更好地发挥功能[31]。农杆菌及病毒性系统由于DNA会被最大限度组装并打包，因而不能大量暴露其序列使其转录，从而了限制gRNA的表达数量。Zhao等[32]通过将两个核酸酶、HH（hammerhead）和另外一个来自于丁型肝炎病毒（HDV）的基因分别克隆到gRNA的下游和上游，从而使其前体RNA准确切割形成有功能的gRNA。

2.2 多基因位点同时编辑

植物多基因位点同时编辑已经有很多应用，如冗余基因敲除、作物育种中多性状的遗传改良等等。早期，研究者通过连续循环克隆将含有不同目的片段的sgRNA表达组件插入到一个二元载体中，实现多位点同时编辑[23，33，34]；或者利用多重限制性内切酶产生不同粘性末端的方法将sgRNA表达组件插入不同位点[33，35]。这些方法不仅限制了sgRNA表达组件的插入数量，而且较为耗时。受到Golden Gate克隆技术[36]的启发，2015年，Ma等[28]利用Golden Gate克隆了水稻具有多个组件的CRISPR/Cas9的二元结构，然后进行单一循环克隆实现了8个位点的插入、7个类似FT的基因同时突变。2017年，Ferreira等[37]课题组利用来自假单胞菌的内切核糖核酸酶Csy4对RNA的加工能力，将基因组编辑的一条RNA加工形成多条gRNAs，同时对酿酒酵母4个基因FAA1、FAA4、POX1和TES1进行删除编辑，其效率达到96%。

3 CRISPR/Cas9 系统在植物方面的应用

2013年，Li等[23]首次利用CRISPR/Cas9 编辑系统在植物体内共表达经密码子最优化的Cas9和gRNA，诱导拟南芥（Arabidopsis）和本生烟（Nicotiana benthamiana）特定基因突变，结果显示，拟南芥基因突变频率在5.6%以下，而本生烟的突变频率在38%左右，该项研究结果第一次证明gRNA/pcoCas9系统能够在植物基因组中发挥作用。随后，各课题组也陆续展开了CRISPR/Cas9系统在其他植物中的研究，包括小麦、玉米、水稻、高粱等（见表2）。2013年，Jiang等[29]也以拟南芥、番茄、高粱和水稻作为试验材料，证明了CRISPR/Cas9系统作为一种灵巧、功能强大的基因组编辑系统，可以短期应用于模式植物及作物基因组编辑。2014年，Feng等[39]同样利用CRISPR/Cas9系统，研究了不同世代具有12个不同目标基因位点的3个拟南芥基因，结果显示不同世代拟南芥的突变率分别为T1代71.2%，T2代58.3%，T3代79.4%。2015年，Yan等[34]利用YAO启动子驱动CRISPR/Cas9系统也实现了拟南芥高效率基因组编辑。2017年，Tang等[40]利用CRISPR/Cas9系统敲除了水稻中OsNramp5基因，产生了低积累镉（Cd）的籼稻，而不会降低产量。同年，Odipio课题组也成功地利用CRISPR/Cas9系统在木薯基因组中实现了多等位基因突变。由此可见，CRISPR/Cas9系统是应用于植物基因组编辑的一种新兴技术。经过这几年发展，科学家应用CRISPR/Cas9系统实现了目标基因删除、添加、激活或抑制，以研究植物基因功能及分子机制。此外，CRISPR/Cas9系统也可用于改进作物重要农艺性状，如产量、抗病性、抗胁迫能力、提高营养价值等。研究表明，重要农艺性状可以通过敲除或下调负调控基因得以控制。例如，

Wang等[41]通过敲除小麦中3个TaMLO同源白粉病易感基因而使其具有抗性；Liu等[42]将水稻中的ERF转录因子基因OsERF922进行突变，从而提高了水稻对真菌的抗性。2015年，Belhaj等[22]研究发现CRISPR/Cas9系统可以作为细菌的一种抗病毒工具，其能够通过剪切病毒DNA来抑制DNA病毒感染植物。2017年，Zhang等[43]利用CRISPR/Cas9系统使粳稻品种中Waxy基因发生功能缺失突变，使粳稻转化为糯稻，而不会影响其他理想的农艺性状，这为改善优秀品种的粘性提供了一个有效和简便的策略。

目前，许多科学家已成功运用CRISPR/Cas9 系统实现了植物目的基因的高效率敲除。然而，通过该系统成功敲进或替换目标片段却极少报道。研究表明，CRISPR/Cas9系统也可以通过HR（homologous recombination）方式编辑目标片段。尽管HR的效率远低于NHEJ（non-homologous end joining），但通過HR能够更加准确地在目标位点引入新的片段。2015年，Cermak等[53]为扩大模板供体序列设计了双生病毒系统，用以促进HR修复途径精确编辑。同时，Endo等[54]研究发现由于DNA连接酶Ⅴ参与NHEJ修复途径，因此可以通过抑制DNA连接酶Ⅴ促进CRISPR/Cas9系统敲进或替换目标片段。

2014年，Schiml等[55]第一次通过CRISPR/Cas9系统利用HR介导的修复机制成功在拟南芥的ADH1基因位点导入了具有卡那抗性的片段。2015年，Cermak等[53]也利用同样的方法在番茄中导入卡那抗性的片段，实现了目标基因组编辑。同年，Svitashev等[30]利用农杆菌转化和离子轰击在玉米中引入了Cas9、gRNA和修复模板片段，成功通过插入目标片段编辑了玉米基因组。有的实验室利用离子轰击在大豆中导入了Cas9、gRNA和修复模板，结果显示其突变可遗传后代[56]。近来有文献报道，水稻通过HR修复方式修饰了其内源性ALS基因，从而使其具有抗除草剂特性。发现当质粒和自由双链DNA形态都存在的情况下，提供HR供体能够提高植物同源重组修复的效率。相反，单链寡核苷酸则不能通过提供HR供体而发挥功能[57]。最近，也有的实验室在拟南芥中发现CRISPR/Cas9系统多个寡核苷酸链模板要比单个寡核苷酸模板具有更高的编辑效率[58]。目前，许多研究人员发现CRISPR/Cas9系统可允许多个sgRNA同时表达，对基因组同时编辑。该项研究在拟南芥[23]、水稻[50]及番茄[52]中均有报道。研究发现在烟草[59]、拟南芥[23]、水稻[50]及番茄[52]中，多个sgRNA可以造成基因组成百上千个碱基缺失。在多倍体小麦中，Wang等[60]运用CRISPR/Cas9系统既可同时突变多个拷贝，也能定向突变单拷贝。2013年，Shan等[61]利用 CRISPR 技术获得了水稻OsBADH2和OsPDS基因突变体。2015年，Zhang等[35]构建了含有Cas9和6个gRNA表达基因序列的载体，虽然编辑效率极低，但也证明CRISPR/Cas9系统能够同时编辑6个目标位点。Wang等[62]也利用同尾酶技术和与之兼容的限制酶实现水稻中3个基因同时编辑。

尽管CRISPR/Cas9系统能够高效并多位点同时编辑目标基因组，但由于其脱靶效应可能导致有害突变和染色体畸形，目前CRISPR/Cas9还存在很多问题。2015年，Ma等[28]在水稻中发现目标基因组中高GC碱基（50%～70%）含量的编辑效率相对更高，但同时也发现sgRNA中目标配对序列茎环结构的形成会降低基因组编辑效率。也有研究表明Cas9∶gRNA复合物能够在较少错配下剪切目标DNA序列，也就意味着该复合物也能够剪切其他基因组位点[63]。有研究报道，Cas9剪切并识别特异位点的碱基数少于20 bp，这更增加了目标位点脱靶的可能性[64]。然而，Mikami[65]和Fauser[45]等研究发现，在水稻和拟南芥中，Cas9的切口酶活性并不能较核酸酶活性提高NHEJ和HR的修复效率，但是能够减少脱靶效应。2017年，LeBlanc等[66]也发现，在受到热胁迫（37℃）的拟南芥中，CRISPR诱导的突变频率要比长时间在标准温度（22℃）下生长的拟南芥高得多，并在柑橘中也观察到该现象，这项研究显示温度在调节真核生物的Cas9活性中可能具有重要作用，并为植物中CRISPR/Cas9系统编辑效率的提高提供一种简单方法。

4 結语与展望

CRISPR/Cas9系统的发现是生命科学在基因组编辑方面迈出的重要一步，具有广泛的发展前景。利用CRISPR/Cas9技术定点敲除不利基因，可以使作物得到精准改良；利用核酸酶介导植物基因的替换、插入或删除，可以使优良基因得以稳定遗传等。毫无疑问，CRISPR/Cas9是作物分子育种的重要手段。但是目前CRISPR/Cas9系统还存在诸多亟待解决的问题，如脱靶效率的降低问题、真核生物的胞毒性问题、目标位点范围的控制问题等。这些问题还需更加深入的思考及研究。目前，解决其脱靶效应高和同源重组（HR）编辑效率低的问题将是实现我国基因精准定点编辑路上的重要一步。总之，CRISPR/Cas9系统在广泛应用过程中必将得到不断改进与完善，必将在植物遗传育种实践中发挥更大作用。

参 考 文 献：

[1] Kim Y G， Cha J， Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes： zinc finger fusions to Fok Ⅰ cleavage domain[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1996， 93（3）： 1156-1160.

[2] Christian M， Cermak T， Doyle E L， et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases[J]. Genetics， 2010，186（2）： 757-761.

[3] Symington L S ， Gautier J. Double-strand break end resection and repair pathway choice[J]. Annu. Rev. Genet.， 2011， 45： 247-271.

[4] Ramirez C L， Foley J E， Wright D A， et al. Unexpected failure rates for modular assembly of engineered zinc fingers[J]. Nature Methods， 2008， 5（5）： 374-375.

[5] Hwang W Y， Fu Y， Reyon D， et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system[J]. Nature Biotechnology， 2013， 31（3）： 227-229.

[6] Doudna J A， Sontheimer E J. The use of CRISPR/Cas9， ZFNs， and TALENs in generating site-specific genome alterations [J]. Methods Enzymol.， 2014， 546：76-549.

[7] Bortesi L， Fischer R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond[J]. Biotechnology Advances， 2015， 33（1）： 41-52.

[8] Ishino Y， Shinagawa H， Makino K， et al. Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product[J]. Journal of Bacteriology， 1987， 169（12）：5429-5433.

[9] Jansen R， Embden J D， Gaastra W， et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular Microbiology， 2002， 43（6）： 1565-1575.

[10]Pourcel C， Salvignol G，Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA， and provide additional tools for evolutionary studies[J]. Microbiology， 2005， 151（Pt 3）： 653-663.

[11]Bolotin A， Quinquis B， Sorokin A， et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats （CRISPRs） have spacers of extrachromosomal origin[J]. Microbiology， 2005， 151（Pt 8）： 2551-2561.

[12]Mojica F J， Diez-Villasenor C， Garcia-Martinez J， et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements[J]. Journal of Molecular Evolution， 2005， 60（2）： 174-182.

[13]Barrangou R， Fremaux C， Deveau H， et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science， 2007， 315（5819）： 1709-1712.

[14]Marraffini L A， Sontheimer E J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA[J]. Science， 2008， 322（5909）： 1843-1845.

[15]Deltcheva E， Chylinski K， Sharma C M， et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase Ⅲ[J]. Nature， 2011， 471（7340）： 602-607.

[16]Sinkunas T， Gasiunas G， Fremaux C， et al. Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system[J]. The EMBO Journal， 2011，30（7）： 1335-1342.

[17]Hale C R， Zhao P， Olson S， et al. RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex[J]. Cell， 2009， 139（5）： 945-956.

[18]Anantharaman V， Iyer L M， Aravind L. Presence of a classical RRM-fold palm domain in Thg1-type 3′-5′ nucleic acid polymerases and the origin of the GGDEF and CRISPR polymerase domains[J]. Biology Direct， 2010， 5：43.

[19]Jinek M， Chylinski K， Fonfara I， et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J]. Science， 2012， 337（6096）： 816-821.

[20]Gasiunas G， Barrangou R， Horvath P， et al. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2012， 109（39）： E2579- E2586.

[21]Hsu L I， Chen C J. Hsu and Chen respond to "implications for prevention and future research"[J]. American Journal of Epidemiology， 2013， 177（3）： 217-218.

[22]Belhaj K， Chaparro-Garcia A， Kamoun S， et al. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9[J]. Current Opinion in Biotechnology， 2015， 32： 76-84.

[23]Li J F， Norville J E， Aach J， et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9[J]. Nature Biotechnology， 2013， 31（8）： 688-691.

[24]Shan Q， Wang Y， Li J， et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system[J]. Nature Biotechnology， 2013， 31（8）： 686-688.

[25]Nishimasu H， Ran F A， Hsu P D， et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA[J]. Cell， 2014， 156（5）： 935-949.

[26]Xie K， Minkenberg B， Yang Y. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2015， 112（11）： 3570-3575.

[27]Mao J， Lv J， Miao Y， et al. Development of a rapid and efficient method for non-lethal DNA sampling and genotyping in scallops[J]. PLoS One， 2013， 8（7）： e68096.

[28]Ma X， Zhang Q， Zhu Q， et al. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient， high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J]. Molecular Plant， 2015， 8（8）： 1274-1284.

[29]Jiang W， Zhou H， Bi H， et al. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis， tobacco， sorghum and rice[J]. Nucleic Acids Research， 2013， 41（20）： e188.

[30]Svitashev S， Young J K， Schwartz C， et al. Targeted mutagenesis， precise gene editing， and site-specific gene insertion in maize using Cas9 and guide RNA[J]. Plant Physiology， 2015， 169（2）： 931-945.

[31]Yu N， Cai W J， Wang S， et al. Temporal control of trichome distribution by microRNA156-targeted SPL genes in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Cell， 2010， 22（7）： 2322-2335.

[32]Zhao L L， Liu H C， Sun Q， et al. Identification of mutations conferring streptomycin resistance in multidrug-resistant tuberculosis of China[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease， 2015， 83（2）： 150-153.

[33]Mao Y， Zhang H， Xu N， et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants[J]. Molecular Plant， 2013， 6（6）： 2008-2011.

[34]Yan L， Wei S， Wu Y， et al. High-efficiency genome editing in Arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system[J]. Molecular Plant， 2015， 8（12）： 1820-1823.

[35]Zhang Z， Mao Y， Ha S， et al. A multiplex CRISPR/Cas9 platform for fast and efficient editing of multiple genes in Arabidopsis[J]. Plant Cell Reports， 2016， 35（7）： 1519-1533.

[36]Engler C， Kandzia R， Marillonnet S. A one pot， one step， precision cloning method with high throughput capability[J]. PLoS One， 2008， 3（11）： e3647.

[37]Ferreira R， Skrekas C， Nielsen J， et al. Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae[J]. ACS Synthetic Biology， 2017， 619/620：587-599.

[38]Nekrasov V， Staskawicz B， Weigel D， et al. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease[J]. Nature Biotechnology， 2013， 31（8）： 691-693.

[39]Feng Z， Mao Y， Xu N， et al. Multigeneration analysis reveals the inheritance， specificity， and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2014， 111（12）： 4632-4637.

[40]Tang L， Mao B， Li Y， et al. Knockout of OsNramp5 using the CRISPR/Cas9 system produces low Cd-accumulating indica rice without compromising yield[J]. Scientific Reports， 2017， 7（1）： 14438-14450.

[41]Wang Y， Cheng X， Shan Q， et al. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew[J]. Nature Biotechnology， 2014， 32（9）： 947-951.

[42]Liu D， Chen X， Liu J， et al. The rice ERF transcription factor OsERF922 negatively regulates resistance to Magnaporthe oryzae and salt tolerance[J]. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（10）： 3899-3911.

[43]Zhang J， Zhang H， Botella J R， et al. Generation of new glutinous rice by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of the Waxy gene in elite rice varieties[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2017： 10.1111/jipb.12620.

[44]Gao Y， Zhang Y， Zhang D， et al. Auxin binding protein 1 （ABP1） is not required for either auxin signaling or Arabidopsis development[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2015， 112（7）： 2275-2280.

[45]Fauser F， Schiml S，Puchta H. Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana[J]. The Plant Journal， 2014， 79（2）： 348-359.

[46]Feng Z， Zhang B， Ding W， et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system[J]. Cell Research， 2013， 23（10）： 1229-1232.

[47]Gao J， Wang G， Ma S， et al. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum[J]. Plant Molecular Biology， 2015， 87（1/2）： 99-110.

[48]Liang Z， Zhang K， Chen K， et al. Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2014， 41（2）： 63-68.

[49]Miao J， Guo D， Zhang J， et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system[J]. Cell Researsh， 2013， 23（10）： 1233-1236.

[50]Zhang H， Zhang J， Wei P， et al. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation[J]. Plant Biotechnology Journal， 2014， 12（6）： 797-807.

[51]Xu R， Li H， Qin R， et al. Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice[J]. Rice， 2014， 7：5.

[52]Brooks C， Nekrasov V， Lippman Z B， et al. Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated9 system[J]. Plant Physiol.， 2014， 166（3）： 1292-1297.

[53]Cermak T， Baltes N J， Cegan R， et al. High-frequency， precise modification of the tomato genome[J]. Genome Biology， 2015， 16：232-245.

[54]Endo M， Nishizawa-Yokoi A， Toki S. Targeted mutagenesis in rice using TALENs and the CRISPR/Cas9 system[J]. Methods in Molecular Biology， 2016， 1469： 123-135.

[55]Schiml S， Fauser F， Puchta H. The CRISPR/Cas system can be used as nuclease for in planta gene targeting and as paired nickases for directed mutagenesis in Arabidopsis resulting in heritable progeny[J]. The Plant Journal， 2014， 80（6）：1139-1150.

[56]Li Z， Liu Z B， Xing A， et al. Cas9-guide RNA directed genome editing in soybean[J]. Plant Physiology， 2015， 169（2）： 960-970.

[57]Sun Y， Zhang X， Wu C， et al. Engineering herbicide-resistant rice plants through CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination of acetolactate synthase[J]. Molecular Plant， 2016， 9（4）： 628-631.

[58]Sauer N J， Narvez-Vsquez J， Mozoruk J， et al. Oligonucleotide-mediated genome editing provides precision and function to engineered nucleases and antibiotics in plants[J]. Plant Physiol.， 2016， 170（4）： 1917-1928.

[59]Belhaj K， Chaparro-Garcia A， Kamoun S， et al. Plant genome editing made easy： targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system[J]. Plant Methods， 2013， 9（1）： 39.

[60]Wang H， Yang H， Shivalila C S， et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J]. Cell， 2013， 153（4）：910-918.

[61]Shan Q， Wang Y， Chen K， et al. Rapid and efficient gene modification in rice and Brachypodium using TALENs[J]. Molecular Plant， 2013， 6（4）： 1365-1368.

[62]Wang C， Shen L， Fu Y， et al. A simple CRISPR/Cas9 system for multiplex genome editing in rice[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2015， 42（12）： 703-706.

[63]Fu Y， Foden J A， Khayter C， et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells[J]. Nature Biotechnology， 2013， 31（9）： 822-826.

[64]Fu Y， Sander J D， Reyon D， et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs[J]. Nature Biotechnology， 2014， 32（3）： 279-284.

[65]Mikami M， Toki S， Endo M. Precision targeted mutagenesis via Cas9 paired nickases in rice[J]. Plant & Cell Physiology， 2016， 57（5）： 1058-1068.

[66]LeBlanc C， Zhang F， Mendez J， et al. Increased efficiency of targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 in plants using heat stress[J]. The Plant Journal， 2017， 93： 377-386.