花生杂交F1种子真伪的分子鉴定研究

仇静静 赵钰涵 邓丽 任丽 夏晗 付春 赵传志 王兴军

摘要：杂交是花生新品种选育的重要环节。为选育抗病、特色的花生新品种，我们分别将抗黄曲霉的 “GT-C20”与感黄曲霉的“Tifrunner”进行正反杂交、抗青枯病的 “J04”和感青枯病的“J62”进行正反杂交、“潍花10号”与黑种皮花生品种“豫花29”进行杂交、大花生品种“丰花1号”与野生资源“SAAS2015ID”进行杂交。本试验利用MITE 转座子和SSR标记对各杂交组合的F1代杂交种进行真伪性检测。根据分子标记检测结果，从254粒杂交F1中共鉴定出96粒真杂交种，真杂种率为37.79%。本研究证明分子标记可有效地对花生杂交后代进行真实性鉴定。在播种前进行真杂种的鉴定可为后续材料的种植节约时间和成本，为遗传群体构建、新品种选育等奠定基础。

关键词：花生；分子标记；微卫星；微型反向重复转座元件；杂交种鉴定

中图分类号：S565.2：Q503文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）02-0013-06

Abstract Hybridization is an important part of peanut breeding. To breed new peanut varieties with special characters and resistance to diseases， the crossing between Tifrunner （susceptible to Aspergillus flavus） and GT-C20 （resistant to A. flavus）， J62 （susceptible to bacterial wilt） and J04 （resistant to bacterial wilt）， Weihua 10 （a high yielding variety in Shandong） and Yuhua29 （a peanut variety with black seed testa）， Fenghua 1 （a high yielding variety in Shandong） and SAAS2015ID （a wild peanut variety） were conducted， respectively. Then the F1 hybrids were tested using the MITE transposons and SSR markers. The results showed that a total of 96 true hybrids were identified from 254 F1 hybrids， and the true hybrid rate was 37.79%. This study showed that the molecular markers could be used to identify the authenticity of peanut hybrids effectively. The identification of true hybrids before sowing could save time and cost for the planting of subsequent materials， and lay foundations for construction of genetic group and breeding of new varieties.

Keywords Peanut； Molecular marker； Microsatellite； Miniature inverted repeat transposable element； Hybrid identification

栽培花生（Arachis hypogaea L.）在中國、印度、美国等广泛种植，是世界上重要的油料作物和经济作物。除了用于榨油外，花生也被用作鲜食或被加工成各种食品，花生在我国农民增收、农业结构调整中有着巨大的发展潜力和重要的产业地位[1]。杂交育种是目前花生品种选育的主要方法。花生属于豆科植物中的蝶形花亚科，花器较小，在杂交去雄的过程中，需要将花萼、旗瓣、翼瓣和龙骨瓣拨开，在不破坏雌蕊柱头的情况下，将四大、四小共八个雄蕊的花药摘除去净[2]。在实际操作过程中，由于去雄不彻底等原因造成花生自交的情况很难避免。为了提高花生杂交育种的效率，对F1杂交种真伪性的鉴定非常有必要。以往主要是通过观察后代的植物学特性、生态习性等选择杂交后代，随着分子生物学技术的发展，利用分子技术鉴定杂交种的真伪，可以从DNA水平上获得更加科学的证据。

根据分子标记开发的分子基础和检测手段，可以将分子标记大致分为三类：以Southern为代表的第一代分子标记，如RFLP；以PCR为基础的第二代分子标记，如SSR、ISSR、RAPD等；以高通量检测为基础的第三代分子标记，如SNP、KASP等。SSR标记（或被称为微卫星标记）在基因组中分布广泛，且具有多态性高、共显性、稳定性好、操作简单等优点，已成为目前用于鉴定真伪杂种的最有效方法之一[3]。基于花生EST、转录组和基因组测序的序列信息，大量的花生SSR标记被开发[4-8]，为利用SSR标记鉴定花生F1杂交种奠定了基础。目前，SSR分子标记已成为花生F1杂交种真伪性鉴定的重要手段[9-11]。微型反向重复转座元件（miniature inverted repeat transposable element， MITE）是生物体中一类DNA转座子[12]。由于MITE在植物基因组中分布广泛，并能产生丰富的插入多态性，且倾向于插入在基因富集区，因此，MITE分子标记也被用作植物遗传多样性分析、遗传图谱的构建及QTL定位[13]。Shirasawa等利用花生的MITE转座子序列，设计引物开发了504对花生 MITE 转座子分子标记，在不同花生品种中的扩增结果表明，这些MITE转座子分子标记多态性高，应用潜力大[14]，在花生杂交种F1真伪鉴定方面也具有很高的效率[15]。另外，也有利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）鉴定花生F1杂交种真伪的报道[16]。这些分子标记技术在花生上的应用，为花生群体的构建、QTL定位和新品种选育提供了帮助。

为了定位花生中与抗病、种皮颜色等性状相关的基因和培育抗病、特色花生新品种，本实验室分别用抗黄曲霉花生品种“GT-C20”与感黄曲霉的“Tifrunner”进行正反杂交、抗青枯病的“J04”和感青枯病的“J62”进行正反杂交、山东主推品种“潍花10号”与黑种皮品种“豫花29”进行杂交、山东主推大花生品种“丰花1号”与野生花生“SAAS2015ID”进行杂交，并构建分离群体。本试验利用 MITE 和SSR分子标记技术对这六个组合的杂种 F1 单株的真实性进行鉴定，可为下一步基因的定位和新品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用花生材料分别为：GT-C20、Tifrunner、潍花10号、豫花29、丰花1号、SAAS2015ID、 J04、J62。其中GT-C20、Tifrunner、潍花10号、豫花29、丰花1号、SAAS2015ID由本实验室保存（表1）。花生种质J04和J62由中国农业科学院油料作物研究所姜慧芳研究员提供。分子标记的引物TE36（TE36F： 5′GGATATGATGCCCATAGCTGA3′，TE36R： 5′TGCTGACTACTTGCAATGCC3′）、TE498（TE498F：5′ATGACTTACATGTAGCAATTG3′，TE498R：5′TGAAAGGAGTCAAAGGTCATG3′）、gSSR-130994（F：5′GTAGAAAGAGAACAAGGGCAAGAA3′，R：5′CTTGCTCGTCTTCTTCCAATAAAG3′）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試验方法

1.2.1 杂交F1种子基因组DNA的提取 收获花生杂交F1代种子后，分别进行编号。用刀片从每粒种子远胚轴端切取约0.03 g的子叶，置于2.0 mL离心管中，加入钢珠，用SCIENTZ-48高通量组织研磨器磨成粉末状，再用植物基因组DNA提取试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）提取DNA。用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度，存于-20℃备用。

1.2.2 PCR 反应体系和程序 PCR反应体系（20 μL）为：ddH2O 6 μL，Forward primer （10 μmol/L） 1 μL，Reverse primer （10 μmol/L） 1 μL，2×Power Taq PCR MasterMix 10 μL，DNA模板 2 μL。在TaKaRa TP600梯度PCR仪上，94℃预变性5 min；94℃变性 30 s，50～60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸7 min，反应结束。

1.2.3 PCR产物的电泳检测 采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物。电泳结束后，取下凝胶进行银染显色：先用固定液（40 mL 95%的乙醇+20 mL 10%的冰乙酸+340 mL蒸馏水）将凝胶冲至脱色盘中，置于脱色摇床上，50 r/min平行摇动5 min以上；蒸馏水轻轻洗一遍凝胶，倒掉废水，加入预先配好的染色液（0.6 g硝酸银+300 mL蒸馏水），50 r/min平行摇动12 min以上；用蒸馏水迅速洗两遍凝胶，倒掉废水，加入显色液（6 g氢氧化钠+2 mL甲醛+400 mL蒸馏水），立即把凝胶展平，使染色液均匀作用，然后50 r/min平行摇动直至显色；倒掉显色液，用蒸馏水清洗两遍，放到凝胶成像系统上观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 “GT-C20 × Tifrunner”正反杂交组合F1种子的分子鉴定

提取杂交F1种子的基因组DNA，利用筛选出的多态性MITE标记TE36对“GT-C20 × Tifrunner”杂交组合进行检测。通过比较亲本和杂交F1的带型，具有父本特异条带的F1种子分别有A1、A4、A5、A6、A7、A8和A11，表明这些是真的杂交种。而A2、A3、A9和A10其带型和母本一致，没有检测到父本的特异性条带，不是真正的杂交种（表1，图1）。

利用筛选出的多态性MITE标记TE498对“Tifrunner × GT-C20”杂交组合进行分子鉴定。部分电泳结果如图2显示，母本Tifrunner只有1条带，父本GT-C20具有3条带，中间的条带大小与Tifrunner条带大小一致，且较其他两条带要弱。杂交F1种子中具有3条带的B2、B3、B4等是真的杂交种。另外，从图2中还可以看出，由于父本和母本条带的叠加，在真杂交种的3条带中，中间的条带最亮，而父本中，中间条带是最暗的（图2，表1）。

2.2 “J04 × J62”正反杂交组合F1种子的分子鉴定

为了定位花生中抗青枯病的QTL，构建了抗青枯病花生材料J04与青枯病敏感花生材料J62的正交和反交组合。通过筛选我们发现标记TE498在两个亲本间具有多态性，在J04和J62中能分别扩增到一条特异性的清晰条带（图3）。利用TE498既可以检测“J04 × J62”也可以检测“J62× J04”杂交F1种子的真伪。

图3 “J04 × J62”部分杂交F1与亲本的分子标记检测利用TE498对“J04 × J62”的杂交F1种子进行检测，部分检测结果如图4所示。具有父本带型的C1、C2、C6等为真的杂交种；而C3、C4、C5等的带型和母本一致，缺少了父本的特异性条带，是伪杂交种。共收获“J04 × J62”组合F1种子45粒，分子标记证明，其中25粒是真杂交种（表1）。

利用多态性标记TE498对“J62 × J04”的杂交F1种子进行检测（图5），共收获F1种子70粒，分子标记证明，其中18粒是真杂交种（表1）。

2.3 “潍花10号 × 豫花29”杂交组合F1的分子鉴定和田间性状调查

利用高产优质花生品种潍花10号做母本、黑种皮花生品种豫花29做父本进行杂交，总共收获杂交F1种子30粒。利用筛选出的多态性标记TE36进行检测，部分结果如图6A所示，其中E1、E2、E3等具有父本豫花29特异条带的为真杂交种，E7等没有父本条带的是伪杂交种，总计获得了21粒真的杂交F1种子，真杂种率为70.00%（表1）。

通过田间表型观察，对分子标记检测的结果进行验证。如图6B所示，潍花10号叶片和叶柄颜色为绿色，而豫花29的叶片颜色为深绿色、叶柄为紫色。而真杂交种叶片颜色介于潍花10号和豫花29之间，即比潍花10号颜色深、比豫花29颜色浅。另外，真杂种F1的叶柄也呈现出紫色，但是颜色要比豫花29浅。叶柄颜色统计结果和分子标记检测结果一致，证明了分子标记检测的可靠性。

2.4 花生栽野杂交组合F1的分子鉴定

野生花生在长期的进化过程中积累了抗病、耐逆等优良性状，为了利用野生花生中的优异基因资源，我们利用山东大花生品种“丰花1号”做母本，野生花生种质资源“SAAS2015ID”做父本进行杂交，共收获杂交F1种子68粒。利用从本实验室开发的花生全基因组SSR标记中筛选出的多态性标记gSSR-130994进行检测，部分检测结果如图7所示，共获得真的杂交F1种子4粒，真杂种的带型为双亲叠加型，如F1、F2、F4和F7，而F3、F5、F6等的带型和母本一致，不是真杂交种。

3 讨论与结论

杂交是群体构建、品种选育、重要基因/QTL定位等的前提和基础，和小麦、水稻等禾本科作物相比，花生种子体积大、繁殖系数较低，花生大群体的构建难度较大，进而影响了花生QTL精细定位、图位克隆等工作的开展。为了获得高质量的遗传群体，对花生杂交F1代进行准确的鉴定显得尤为重要。在分子标记没有普及之前，对花生F1代的鉴定一般是基于对F1代田间表型的鉴定，或者根据F2∶3的表型分离情况倒推F1代的真伪，真伪并存的F1和F2均需要单株种植，浪费了大量的人力、物力资源。随着分子标记技术的发展和进步，利用分子标记对F1代进行鉴定越来越被重视。花生F1代的鉴定大多是用花生苗期的叶片。本研究利用收获的F1代花生种子，切取子葉远胚端的部分组织，进行基因组DNA提取，在不影响种子发芽的情况下完成F1代杂交种的真伪鉴定，可以在播种之前将伪杂交种去除，节省了时间，节约了试验用地以及花生种植、管理的费用。

为了分析切除部分子叶后的花生种子活力，我们利用自主选育的两个花生品种济花1号、济花3号，以及花生基因组测序品种Tifrunner进行了发芽率试验。结果表明，在切除叶远胚端的部分组织（大约30 mg）后，种子的发芽率并没有受到影响。但是裸露的子叶由于缺少了种皮的保护，在大田播种时容易吸引蚂蚁。所以，对检测后的真杂交种播种前，应该作适当的药剂拌种处理。

本研究结果证明，分子标记可有效地对花生杂交后代进行真实性鉴定，在播种前确定真杂种可为后续材料的种植节约时间和成本，为遗传群体构建、新品种选育等奠定基础。

参 考 文 献：

[1] 王兴军， 张新友. 花生生物技术研究[M].北京：科学出版社， 2015.

[2] 胡景荪. 提高花生杂交工效经验点滴[J]. 花生学报， 1982（2）：36.

[3] Powell W， Machray G C， Provan J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats[J]. Trends in Plant Science， 1996， 1（7）： 215-222.

[4] Liang X， Chen X， Hong Y， et al. Utility of EST-derived SSR in cultivated peanut （Arachis hypogaea L.） and Arachis wild species[J]. BMC Plant Biology， 2009， 9（1）： 35.

[5] Song G Q， Li M J， Han X， et al. EST sequencing and SSR marker development from cultivated peanut （Arachis hypogaea L.） [J]. Electronic Journal of Biotechnology， 2010， 13（3）： 1-9.

[6] Wang J Y， Pan L J， Yang Q L， et al. Development of EST-SSR markers in peanut （Arachis hypogaea L.） [J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2009， 5 （3）： 268-273.

[7] Zhao C， Qiu J， Agarwal G， et al. Genome-wide discovery of microsatellite markers from diploid progenitor species， Arachis duranensis and A. ipaensis， and their application in cultivated peanut （A. hypogaea）[J]. Frontiers in Plant Science， 2017， 8：1209.

[8] Zhong R， Zhou M， Zhao C， et al. SSR marker development from peanut gynophore transcriptome sequencing[J]. Plant Breeding， 2016， 135（1）： 111-117.

[9] 陈静， 胡晓辉， 石运庆， 等. 花生品种间杂种F1代的SSR标记分析[J]. 核农学报， 2009，23（4）：617-620.

[10]李双铃， 王辉， 任艳， 等. 利用荧光标记SSR技术鉴定花生F1代杂交种[J]. 花生学报， 2009，38（4）：35-38.

[11]王瑾， 李玉荣， 张嘉楠， 等. 花生杂交种F1真伪的SSR标记检测[J]. 中国油料作物学报， 2013，35（增刊）：171-175.

[12]Bureau T E， Wessler S R. Tourist： a large family of small inverted repeat elements frequently associated with maize genes[J]. Plant Cell， 1992， 4（10）： 1283-1294.

[13]Amundsen K， Rotter D， Li H M， et al. Miniature inverted-repeat transposable element identification and genetic marker development in Agrostis[J]. Crop Science， 2011， 51（2）： 854-861.

[14]Shirasawa K， Koilkonda P， Aoki K， et al. In silico polymorphism analysis for the development of simple sequence repeat and transposon markers and construction of linkage map in cultivated peanut[J]. BMC Plant Biology， 2012， 12（1）： 80.

[15]尹亮， 任艷， 石延茂， 等. 利用Ahmite1转座子分子标记鉴定栽培花生杂交F1代种子真伪[J].山东农业科学， 2015，47（12）：1-5.

[16]韩燕， 马登超， 刘译阳， 等. 利用特异性SNP位点鉴定花生杂交F1代真假杂种[J].山东农业科学， 2016，48（4）：14-17.