柿饼污染霉菌的分离鉴定及生物学特性研究

张倩 白冬红 张晶 陈义伦 辛力

摘要：为控制柿饼霉变，以发霉的小萼子柿饼为原料，对其中霉菌进行分离纯化，并对主要霉菌进行鉴定和生物学特性研究。结果表明，从发霉柿饼中分离得到两株优势菌S1和S2，通过形态学和分子生物学鉴定，S1为产黄青霉，S2为黑曲霉；菌株S1产黄青霉的最适生长条件为：温度25℃，湿度大于70%，pH 5～7，热致死温度和时间为65℃、5 min或70℃、1 min；菌株S2黑曲霉的最适生长条件为：温度30℃，湿度大于70%，pH 5，热致死温度和时间为65℃、15 min或70℃、1 min。

关键词：柿饼；霉菌；分离与鉴定；生物学特性

中图分类号：S665.209文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）02-0076-07

Abstract Using the moldy dried persimmon of Small Calyx as experimental materials， the main mold strains were isolated and identified by morphological and molecular biological methods， and their biological characteristics were also studied. Two dominant strains， named S1 and S2 were isolated and identified as Penicillium chrysogenum and Aspergillus niger respectively by morphological and molecular biological methods. The optimal growth conditions for S1 strain were temperature as 25℃， humidity as more than 70%， pH value as 5.0～7.0，thermal death point and time as 65℃ and 5 minutes or 70℃and 1 minute. The optimal growth conditions for S2 strain were temperature as 30℃， humidity as more than 70%， pH value as 5.0， thermal death point and time as 65℃ and 15 minutes or 70℃ and 1 minutes.

Keywords Dried persimmon； Mold； Isolation and identification； Biological characteristics

柿（Diospyros kaki） 原產于我国，是我国重要的特色水果之一。我国柿品种繁多，据全国柿资源调查统计，有1 058种，其中大多数是我国特有品种[1]。柿饼由于加工制作简单、耐贮藏运输而成为柿子加工的主产品。柿饼富含果糖、葡萄糖、天然有机酸、锰、钙、维生素等，是养生食品中的佳品[2]，且颇具医疗保健作用[3]。柿饼中还含有较多的天然抗氧化物，可以防止一些疾病的发生[4，5]。

柿子资源丰富，且采收期短，所以将不宜鲜食的柿子加工成柿饼是一个很好的选择。传统的柿饼加工多采用自然干制法，该法基本靠露天晒和风吹，需要长达数月的时间来完成干燥，且多由各家各户分散加工，生产条件粗放，生产的标准化、机械化和规模化程度均较低，加上柿子糖含量偏高，柿饼很容易受到微生物主要是霉菌的污染[6]，产品卫生质量较差[7]。

在我国，含水量较高的柿饼（30%～40%）一般采用冷冻或冷藏保存，柿饼进入零售市场（超市）后，往往所处环境为常温，散装柿饼会很快失水干缩变硬，口感品质劣变，严重影响销售；密封保湿包装，则随着柿饼中二氧化硫的散失，柿上会有霉菌生长，存在卫生安全问题。而且在常温下柿饼7天左右就开始霉变，严重影响柿饼品质以及在国际市场中的竞争力。基于此，本研究在霉变柿饼上分离纯化霉菌，对主要霉菌采用形态学和分子生物学方法进行鉴定，对主要霉菌的菌学特性进行研究，可为有效控制柿饼霉变和延长货架期提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品

小萼子柿柿饼，潍坊临朐神力有限公司提供。选择当年自然干燥的小萼子柿饼，发霉后放入无菌样品袋中，编号备用。其水分含量为41.67%，水分活度为0.876，可溶性糖含量为43.61%，总酸含量为1.17 g/kg，含硫量18.4 mg/kg；霉菌总数为35 cfu/g。

1.2 试验方法

1.2.1 霉菌的分离、纯化与保存 ①菌种分离：在超净工作台上，用无菌刀片切取柿饼的发霉部分，切碎，加入90 mL无菌水进行悬浮；28℃、180 r/min下振荡培养30 min，取悬浮液制成稀释倍数为101、102、103、104、105、106的稀释液；取稀释液1 mL加入灭菌培养皿中，倒入冷却至50℃左右的孟加拉红培养基，摇匀，25℃恒温培养5～7 d[8]。

②菌种纯化：采用平板划线分离法，用接种环以无菌操作挑取含菌样品在固体培养基表面作有规则划线，菌株经过多次从点到线的稀释，最后经培养得到纯种单菌落[9]。

③菌种保藏：将纯菌株接种于PDA斜面培养基上培养至长满斜面，4℃保存备用。

1.2.2 霉菌菌株的形态学鉴定 ①点植培养法[14]：从纯化菌种平板上挑取单个孢子或菌落，点植于PDA培养基、察氏培养基（CA）和察氏酵母膏培养基（CJA）上等边三角形三个顶点或中心处，倒置于28℃恒温箱中培养，每天观察其生长形态。

②显微镜直接观察法：在载玻片上滴加一滴乳酸苯酚溶液，用接种针挑取菌落，平摊于玻片上，加盖盖玻片镜检。

1.2.3 霉菌菌株的分子生物学鉴定 ①DNA提取：将所得优势菌株在PDA培养基上28℃恒温倒置培养7 d后，通过真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA。

②PCR扩增：扩增使用的上游引物为ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′），下游引物为ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

PCR扩增的反应体系为：50 μL，其中10×buffer 5 μL；Mg2+4 μL；dNTP 4 μL；引物各2 μL；Taq酶2 μL；模板4 μL；双蒸水补足到50 μL。PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，50℃复性1 min，72℃延伸1 min，30個循环，最后72℃保温10 min。4℃保存[10，11]。

测序分析：将PCR扩增产物送上海生工进行测序。测序的拼接结果在NCBI上进行BLAST比对，根据比对结果，构建系统发育树[12]。

1.2.4 主要污染霉菌的生物学特性研究 ① 温度对霉菌生长的影响：将培养7 d左右的霉菌S1、S2利用8 mm打孔器打成菌饼[13]，放置于PDA培养基中央，分别在4、20、25、30、35、40℃下培养5～7 d，测定其净生长直径。

净生长直径（cm）=菌落直径-0.8

②湿度对霉菌生长的影响：将培养7 d左右的霉菌S1、S2利用8 mm打孔器打成菌饼，放置于PDA培养基中央，置于环境湿度为50%、60%、70%、80%、90%下，28℃培养5～7 d，观察生长情况，并测定其净生长直径。

③pH值对霉菌生长的影响：将培养7 d左右的霉菌S1、S2利用8 mm打孔器打成菌饼，移到pH值分别为3、5、7、9、11的培养基上，置于28℃下恒温培养，观察生长情况，并测定其净生长直径。

④霉菌致死温度和时间测定：将在PDA斜面上培养7d的霉菌制成浓度为106个/mL的孢子悬浮液，取1 mL放入1.5 mL灭菌离心管中，分别置于50、55、60、65、70℃恒温水浴锅中处理1、5、10、15、20、25 min后迅速冷却，之后用吸管取0.1 mL培养液到培养基上，涂平板，28℃下倒置培养，观察霉菌菌落生长情况。

2 结果与分析

2.1 柿饼污染霉菌的分离

经分离纯化，得到7株霉菌。选取其中2株优势菌株S1和S2进行以下试验。

2.2 主要霉菌的形态学鉴定

S1在PDA培养基上培养7 d的菌落形态如图1a、b所示，可见，S1菌落颜色为淡蓝绿色，菌落表面有密集的淡黄色液滴，背面为浅黄色；在显微镜下观察的菌株形态如图1c所示，可见，孢子囊呈扫帚状。

S2在PDA培养基上的菌落形态如图2a、b所示，可见，菌落初期为白色，5～7 d后为灰黑色，长而厚，呈棉絮状；在显微镜下观察的菌株形态如图2c所示，可见，分生孢子为球形，呈黑褐色。

结合S1和S2在CA培养基和CJA培养基上培养7 d形态观察以及在显微镜下的菌丝形态观察，初步判定S1为青霉属，S2为曲霉属。

2.3 主要霉菌的分子生物学鉴定

2.3.1 DNA提取及PCR扩增 由图3可知，S1和S2 PCR扩增产物的序列长度均在750 bp左右。

2.3.2 测序结果 测序结果见图4。

2.3.3 系统发育树的构建 将PCR产物测序结果在DNAMAN上进行拼接，并将该序列在GenBank上进行BLAST比对，挑选同源性高的基因序列构建系统发育树（见图5和图6），可知，菌株S1与产黄青霉的同源性较高，S2与黑曲霉的同源性较高，结合形态鉴定和生理生化鉴定结果，最终鉴定霉菌S1为产黄青霉，霉菌S2为黑曲霉。

2.4 主要霉菌的生物学特性

2.4.1 温度对霉菌生长的影响 如图7所示，霉菌S1产黄青霉和霉菌S2黑曲霉均能在较大的温度范围内生长，且S1在25℃下长势最好，S2在30℃下长势最好，因此霉菌适宜生长的温度为25～30℃，且在4℃下几乎不生长。因此柿饼在冷藏条件下储藏，可以有效防止霉变；而常温（20～30℃）则是霉菌滋生的敏感温度。

2.4.2 湿度对霉菌生长的影响 如图8所示，霉菌S1产黄青霉和霉菌S2黑曲霉均在湿度大于60%时开始生长，并且随着湿度增加，霉菌S1和S2的生长速度均显著增加，因此在柿饼贮藏的过程中要保持通风干燥，使柿饼处于相对湿度较低环境中（60%以下），将有利于防止霉菌的生长繁殖。

2.4.3 pH值对霉菌生长的影响 霉菌对酸碱度不太敏感，一般在pH值3～9都能生长。由图9可知，霉菌S1产黄青霉适宜生长的pH值范围是5～7，霉菌S2黑曲霉的最适生长pH值为5，这两菌株均适宜在酸性条件下生长。

2.4.4 霉菌的热致死温度和时间测定 两种霉菌的耐热性结果如图10和图11所示，霉菌S1产黄青霉和S2黑曲霉在55℃以上均能被致死，并且随着温度和时间的增加，致死率显著增加。霉菌S1产黄青霉在65℃、5 min或70℃、1 min时致死率均能达到100%，霉菌S2黑曲霉在65℃、15 min或70℃、1 min时致死率均达到100%，黑曲霉的耐热性更强，因此可以使用热烫的方法在短时间内杀死霉菌。

3 讨论与结论

3.1 污染霉菌的分离鉴定

霉菌是导致柿饼成品霉变腐烂的主要原因，大大降低柿饼品质及食用价值，越来越多地引起柿饼加工企业的关注。本研究对柿饼进行霉菌的分离鉴定，最终确认柿饼的主要霉变菌，并研究其菌学特性，有利于控制霉变，从而达到延长柿饼保质期的目的。

由于真菌种类繁多、分布广泛、形态特征复杂，准确鉴定真菌病原菌是一项复杂而艰巨的工作。此外，由于真菌的形态特征与生理生化指标易随环境条件的变化而表现出不稳定性，因此传统的真菌分类和鉴定方法不能准确鉴定到种的水平。鉴于传统的病原真菌分类和鉴定的局限性，采用扩增真菌rDNA-ITS 进行真菌菌株的鉴定和系统发育研究，已成为植物病原学的研究热点[15]。崔雨琪等从土壤中分离得到一株产酸能力较高的真菌，经形态学及ITS rDNA基因序列分析鉴定为黑曲霉[16]。田峰等将一株来源于浙贝母新鲜鳞茎的内生真菌菌株FTJZZJ09经ITS rDNA基因序列鉴定为产黄青霉[17]。Luo等对深海中得到的菌株DY-F2利用ITS鉴定，确定为产黄青霉[18]。本研究从发霉柿饼中分离得到两株主要霉菌污染菌S1和S2，通过形态观察及ITS rDNA序列对比并构建系统发育树，最终确定为产黄青霉和黑曲霉，这与王春红[14]和张晓旭[19]等的研究一致，验证了前人结论。

3.2 污染霉菌的生物学特性研究

真菌的生长繁殖需要一定条件，主要有营养基质、温度、湿度、酸碱环境、呼吸环境等，因此，研究分离菌的生长特性，可为控制其生长提供依据。本研究发现，分离出的两株霉菌在4℃下不生长，所以建议柿饼的贮运和超市销售温度条件为0～4℃；两株霉菌在湿度60%以下几乎不生长，因此在柿饼的包装和销售过程中要保持一个干燥的环境；产黄青霉和黑曲霉的热致死温度较低，因此可以在包装前热处理杀灭柿饼表面霉菌，但是短时间加热是否会使其返涩，还有待进一步研究。

参 考 文 献：

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