卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术规范

2018-03-29梁珊珊黄国宁孙海翔范立青冯云沈浣刘平卢文红张云山王秀霞张松英黄学锋伍琼芳全松周从容周灿权师娟子孙莹璞滕晓明

生殖医学杂志 2018年11期

梁珊珊，黄国宁，孙海翔，范立青，冯云，沈浣，刘平，卢文红，张云山，王秀霞，张松英，黄学锋，伍琼芳，全松，周从容，周灿权，师娟子，孙莹璞，滕晓明

(中华医学会生殖医学分会第四届委员会)

背景

卵胞浆内单精子注射(ICSI)技术自1992年第一例婴儿诞生起，为辅助生殖技术(ART)开辟了新的领域，并在世界范围内广泛应用。为推动ICSI技术在我国应用的健康发展，规范ICSI技术的操作流程，中华医学会生殖医学分会实验室学组根据国内外已发表的文献，参考国外现行应用的相关指南(ESHER 2015 Revised guidelines for good practice in IVF laboratories；NICE 2014 Fertility problems Quality standard)和中华医学会生殖医学分会“人类体外受精-胚胎移植实验室操作专家共识”，结合参加编写专家的经验，广泛征求胚胎实验室技术人员意见的基础上，基于实验室和辅助生殖技术后代安全性立场考虑，经过交流讨论达成了本ICSI操作技术规范。

方法和内容

本技术规范内容包含ICSI基本条件、操作前准备、操作过程、特殊情况处理。

一、基本条件

1.配子操作环境：与IVF实验室配子/胚胎操作区域环境控制原则相同，并需按照技术规范，采取措施降低操作区域内VOC含量。

2.人员：ICSI技术人员需按照规范要求在辅助生殖技术培训基地接受培训并考核合格，再经过动物配子和人类配子操作训练后，具备熟练的显微操作及体外受精-胚胎移植实验室技能。在后续工作中还需进行持续质控。

3.仪器：除IVF技术常规仪器，需要增加倒置显微镜及显微操作系统。建议配置2套，以备检修。显微操作系统可以是液压和/或气压系统。

开展男科显微手术取精的中心需要配备相关显微显像及手术设备，开展冻精复苏后ICSI的中心需配备相关的设备。

4.耗材和试剂：除IVF常规用品，还需要适宜管径的拆卵针(内径分别为450～500 μm、150～200 μm、130～140 μm的毛细管)、ICSI操作皿、无需CO2平衡的配子操作液(以下简称操作液)、透明质酸酶、精子制动试剂(如PVP)。

注射针和固定针有0°、20°、25°、30°、35°等多种角度，建议采用30°角。注射针的内径一般为5 μm，外径为7 μm；固定针内径有15 μm和25 μm，外径均为100 μm。

开展冷冻精子ICSI的中心需要精子冷冻及解冻试剂盒。

二、ICSI操作的准备

1.卵母细胞的脱颗粒细胞：卵丘复合物移入透明质酸酶中，颗粒细胞松散后移入配子洗涤液中，用内径适宜的拆卵针反复吹吸，使颗粒细胞脱落。

注：透明质酸酶使用参考试剂说明书，尽量减少透明质酸酶和卵子接触的时间(因各种酶制剂活性成分不同，如说明书中提及此时间需控制在1 min之内，则需严格遵照；如未提及具体时间限制，亦不可过久)；脱颗粒后充分洗涤卵子[1]。如果卵子数较多(一般超过10枚以上)，建议分批处理。

2.卵母细胞评估：去除颗粒细胞后，观察卵母细胞。卵周间隙见第一极体提示卵子核成熟，可用于ICSI。如观察发现GV期、MI期、特大极体(大于14 μm)、巨卵(卵子直径大于200 μm)应不予ICSI[1]；发现多极体、胞浆空泡等需记录；发现卵周间隙过大、极体碎裂及可疑多极体的卵子如有条件可使用纺锤体观测仪选择穿刺点。

全部卵子均为未成熟卵子时考虑行IVM后ICSI(实验室学组专家共识试行指南2016)。

3.注射皿准备：可将精子制动液滴(如PVP微滴)置于注射皿中央，周围放置配子液微滴。用矿物油覆盖微滴。将处理后的精子悬液移入微滴，卵子逐个移入其余微滴。

注：每皿注射卵子数不宜过多(原则上可根据操作熟练程度，预计培养箱外操作时间不超过10 min，减少失温对卵子产生的不利影响)。

4.操作系统的调试：恒温台温度控制在37℃。调节注射针和固定针的手柄放置正中位置，旋钮的指针处于正中位置。根据ICSI注射针和固定针的规格角度调试两侧持针臂的角度。装针前保证两侧持针臂在同一矢状面，然后在低倍镜下安装注射针和固定针，之后转换高倍镜，再调整注射针和固定针的水平位置和垂直位置。

注：显微控制系统非工作状态时，持针臂抬高。液压系统更换时管道内不进空气，保证顺利通畅。建议显微操作时使用目镜10倍，物镜20倍。

5.精子处理：射出精液处理同常规IVF，收集活动精子备用。冷冻精子解冻后应用，参考精子冷冻解冻试剂盒说明。附睾手术所取精子可直接装入注射皿或洗涤后使用，睾丸组织需要机械法拆碎曲精小管，制成精子悬液备用。

注：当精液中红细胞数量较多，精液粘稠度高或逆行射精标本建议行非连续密度梯度离心处理。

三、ICSI操作

1.ICSI时机：正常受精需要卵母细胞核成熟以及胞质成熟。胞核成熟明显标志为第一极体排出，但胞质成熟更为复杂[2]。在自然状态下，两者应该同步，但在促排周期中表现非同步[3]。在IVF或ICSI前的培养，能使胞质进一步成熟。但长期停留在MII阶段未受精，颗粒细胞凋亡可能使得卵子发生老化[4]。ICSI取卵、脱颗粒细胞、注射操作之间的最佳时间间隔尚无明确定论。现阶段证据指出，HCG后>36 h取卵，带颗粒细胞培养结局更好；脱颗粒>5 h后ICSI对结局会有负面影响[5-6]。建议HCG后38～40 h行ICSI授精。

2.精子制动：在精子微滴中尽量选择形态正常的活动精子，用ICSI注射针转移到PVP微滴中。用ICSI注射针将精子的尾部中段1/3处垂直压在培养皿底部，轻柔拉动，划破尾部胞膜后精子尾远端停止摆动，近头端可仍稍有摆动，有时可见明显折痕。注：不推荐在精子微滴中或在不加PVP的操作液中进行制动。精子制动后尽快注射。

3.注射时第一极体位置：第一极体位于6点或12点，注射点3点时，精子头或者尾先进入胞质不影响受精率和优胚率[7]。各种研究提示，精子与纺锤体位置近可能提高受精及优胚率[8-10]。

推荐注射时第一极体位于11～12点。

4.卵胞浆内单精子注射：将制动后的精子吸入注射针，使精子头位于注射针尖端。将含精子的显微注射针和固定针移入含卵子的微滴中。用固定针固定卵子，使第一极体位于11～12点位置。将ICSI注射针穿过透明带，进入卵母细胞胞质内。穿刺针头部过中线位置后缓慢回吸胞浆液至突然加速，提示卵母细胞破膜，停止回吸，将精子慢慢注入卵子中心区域，精子头部进入胞质后，稍作停顿，再缓慢退出注射针。固定针释放卵子后退出液滴。不推荐在注射针内同时间隔一定距离吸入多条精子进行ICSI，虽然可以缩短注射时间，但增加了ICSI操作难度和风险。

注射后的卵子移入培养皿内，放入培养箱，同IVF胚胎培养。

注：尽量减少注射入卵胞质内的PVP。

四、特殊情况处理

1.MI卵：临床上约有15%卵子处在未成熟阶段，但因临床和技术难度，IVM技术仍然只在少数中心作为常规操作[11]。2010年研究提示，经过24 h培养成熟的卵子非整倍体率100%，经4～8 h培养成熟时非整倍体率为66.6%，短期(2 h)培养成熟时非整倍体率接近正常PGD(40.3%)[12]。尽管使用MI成熟后受精的胚胎可以增加数量，但由于高的非整倍体率和临床结局不良，需要考虑非整倍体筛查[13]。

2.卵子退化：ICSI后卵子退化率可在5%～19%[14-15]，目前一般在5%左右。可发生在进针/出针时胞浆溢出，或者第二天检查受精时发现胞质固缩[16]。

2006年研究提示，D3 FSH水平、获得成熟卵数、HCG日E2水平是卵子退化率的独立显著相关因素[16]。发生卵胞膜突然破裂、破裂困难[14]、抽针后无针道[17]可能与卵子退化率增高有关，提示卵子质量差。透明带异常、细胞骨架损伤可能与卵子退化相关。脱颗粒细胞不完全时，虽然可以继续胚胎发育，但也与退化率增高有关，原因可能是注射时遮挡视线以及固定困难[18]。

建议使用3～5 μm内径的细针(常规使用直径5～7 μm)，优点是卵胞膜损伤小、胞浆吸出少、进入的PVP少。建议控制正常形态MII卵子注射后正常受精率不低于70%，卵子退化率不高于10%。

前次卵胞膜突然破裂、高退化率(>20%)的卵子经过激光辅助孵化(AH)后受精率可增高，胚胎质量改善[19]。AH理论上可能诱发孵出时囊胚嵌顿，但尚无单卵双胎报道。对非选择性患者AH后ICSI并无明显益处[20]。

3.裸卵：体外操作时透明带丢失而卵胞膜完整，或卵子生成时透明带缺如的卵母细胞称为裸卵。透明带先天缺如者可能涉及遗传异常。裸卵多数丢弃，但获卵数很少的时候可以培养至囊胚期移植并获得妊娠[21]。2014年研究135枚裸卵与正常卵子对比，受精率、卵裂率、囊胚形成率、优质囊胚率均无显著差异，解冻复苏率及活产率、孕周及出生体重无显著差异[22]。但不建议卵裂期移植，以避免卵裂球分离。

4.受精失败：ICSI完全受精失败少见，发生率约1%～3%，但即便是精子正常时也可能发生[23]。低受精率<30%会在某些患者身上重复发生[24]。

IVF受精失败时60%～90%卵子不含精子核，提示主要原因是精子穿透失败[25]；但ICSI受精失败时60%～70%的未受精MII卵子中可见肿胀的精子头，提示与卵子活化异常有关；其他原因还有精子头解聚异常、精子染色质解聚异常、纺锤体异常、精子星状体异常和单纯精子注射失误等[26-27]。

小鼠卵活化实验(MOAT)可用来鉴别精子受精能力[28]。受精率可分为低活化率(<20%)、中等(21%～84%)、高(>85%)。精子异常大多表现为低活化率，高活化时基本可排除精子异常。圆头精子症患者理论上AOA结局良好。对于MOAT高活化率组受精低下的患者可能还有其他因素，建议部分卵子AOA[28-29]。

卵子人工激活(AOA)可对精子及卵子活化异常起作用。显微操作改良、物理(电)、化学方法等方案多样。

人类卵子人工激活安全性研究现有2014年报道21名经AOA出生的已超过3岁的子代随访，新生儿期指标、行为及神经发育在正常范围内[30]。更加全面的安全性讨论尚需病例积累及长期随访。

5.圆头精子：所有精子均为圆头精子患者临床罕见，发生率<0.1%。特征是精子头为圆型，顶体缺失，核胞膜异常，中段缺陷。DNA碎片显著增高，但非整倍体率轻微升高[31-32]。ICSI技术出现之前，此类患者不育。但常规ICSI后仍受精率低，出生率低。

2013年34名圆头精子症患者AOA化学法受精率正常。而无论是常规ICSI还是AOA后，DPY19L2突变患者比非突变者受精率均稍高。对部分圆头精子的患者建议部分卵子AOA，鉴别卵子异常[33]。

6.不动精子：高倍镜下持续观察精子未见任何主动运动的称为不动精子。射出精子如100%不动，可行睾丸穿刺尽量取活动精子。

鉴别存活精子可采用添加己酮可可碱[34]、低渗肿胀实验、激光法[35]或机械法折尾[36]等，存活精子可表现为尾部肿胀或因刺激发生卷曲及抖动。注意：经冷冻解冻后精子尾部可自发肿胀卷曲，不能直接认定为活精子。

7.其他：针对一些可能受精率低下的特殊病例时，会选取除常规IVF及ICSI之外的其他授精方式。例如一半卵子IVF/一半卵子ICSI的half-ICSI方式，或是加精后当日去除颗粒细胞观察第二极体排出情况的rescue-ICSI，ICSI的操作过程无特殊要求。