参与DNA损伤应答的长链非编码RNA

欧阳灿,黄 慧,唐 芳,周 征

（湖南大学生物学院,中国湖南长沙410082）

活细胞的基因组每天都会产生数以万记的损伤,细胞自身的代谢产物和外部的物理、化学因素都可以损伤DNA。例如:细胞正常代谢产生的活性氧类（reactive oxygen species,ROS）可使鸟嘌呤（G）氧化成8-氧鸟嘌呤（8-oxoG）,8-oxoG不再与胞嘧啶（C）配对,而与腺嘌呤（A）配对,最终使DNA链上的G-C转换成T-A,从而导致DNA上碱基的突变[1]。外源的紫外光照射会使DNA同一条链上相邻的两个嘧啶（以TT最为常见）以共价键的形式形成环丁烷嘧啶二聚体（CPD）或嘧啶（6-4）光产物二聚体（6-4PP）[2]。生物在进化过程中,为了维持遗传信息的稳定,细胞内逐步演化出了一套能感应识别DNA损伤,传递DNA损伤信号,激活细胞周期检验点,引发细胞周期阻滞,促进DNA损伤修复或者启动凋亡程序（当损伤不能修复时）的DNA损伤应答（DNA damage response,DDR）机制[3]。若细胞内DDR机制存在缺陷,将有可能导致基因组的不稳定,从而引发神经退行性疾病、癌症、免疫缺陷等相关疾病[4]。因此,DDR研究已成为生命科学研究的热点和前沿方向之一。对DDR的研究有助于更深入地理解细胞应对各种DNA损伤胁迫的反应,以及癌症等疾病发生、发展的机理,从而为这些疾病的治疗提供理论指导和个性化治疗方案。

长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸且不具有编码能力的RNA分子。与信使RNA（mRNA）类似,大部分lncRNA也是由RNA聚合酶域催化合成,且具有5,帽子和3,poly（A）的尾巴[5,6]。根据转录出长链非编码RNA的DNA片段与靶标蛋白质编码基因之间的相对位置,一般将lncRNA分为五类:同义 lncRNA、反义 lncRNA、内含子 lncRNA、双向lncRNA和基因间lncRNA[7]。随着测序技术的发展,越来越多的lncRNA被发现。NONCODE数据库是非编码RNA领域的专业数据库,记录了至少17万种lncRNA。研究表明lncRNA具有多种功能,能通过与蛋白质、RNA、DNA相互作用参与多种生物学过程,如细胞增殖分化[8]、多能性维持[9]、DDR[10]等。而且lncRNA转录及调控的异常是导致基因不稳定和许多疾病发生、发展的重要机制。例如:在原发性乳腺癌和转移癌中,人们鉴定了一种高表达lncRNA-HOTAIR,它通过与PRC2（polycomb repressive complex 2）复合物结合将该复合物引入到特定的靶基因上（其中包括乳腺癌抑制基因,如HOXD10、JAM2、EPHA1）,导致组蛋白 H3第27位赖氨酸甲基化,抑制靶基因的表达,从而有利于肿瘤的侵袭和迁移[11]。另有研究发现在亨廷顿舞蹈症患者体内HAR1、NEAT1和DGCR5等lncRNA的转录发生了变化[12]。因此鉴定更多参与DDR的lncRNA,探索它们在DDR中发挥的功能,能加深我们对DDR机制理解的深度和广度,更能全面掌握某些疾病发生、发展的机理,为临床治疗提供理论指导和依据。

1 引起细胞DDR的胁迫能诱导lncRNA转录发生变化

引起细胞DDR的胁迫通常是基因组上的DNA损伤,一些治疗癌症的药物也会l成DNA损伤而诱发DDR,如阿霉素、博来霉素、顺铂、依托泊苷等。其中,依托泊苷为细胞周期特异性抗肿瘤药物,它通过形成一种药物-拓朴异构酶域-DNA的复合物,导致DNA单链或双链断裂;而顺铂r与DNA形成交叉联结引发同一条DNA链或不同DNA链交联[13]。细胞应答DNA损伤时需要多个通路参与,因而应答不同物质引起的胁迫,细胞会启动不同的通路且需要不同的功能因子参与。lncRNA是最新发现的参与DDR的功能因子,也是了解最少的DDR功能因子。

研究表明细胞在应答DNA损伤时,许多lncRNA的转录会发生变化。其中部分lncRNA的转录是由DNA损伤发生后激活的P53、E2F1等转录因子来调控的。Sanchez等[14]通过RNA-seq和P53-ChIP-seq对受到DNA损伤后的人体癌细胞进行分析,新发现了18条受P53调控的lncRNA,其中有两条已经证实参与调节了P53通路,促进了DNA损伤诱导的细胞凋亡。另有研究发现数条lncRNA的启动子区域或转录起始位点下游包含有P53的结合位点,如lincRNA-p21、lincRNA-Mkln1、PANDA、TUG1、PVT1。当细胞经过DNA损伤诱导剂处理产生DNA损伤后,P53直接与其结合诱导这些lncRNA的转录[15～18]（图1）。相关报道显示,部分lncRNA受P53的间接调控,如lncRNALINP1在过表达P53的乳腺癌细胞和结直肠癌细胞中的表达明显降低,且在其转录区域并没有P53结合位点,但是在其第2个外显子区域有miR-29的结合位点,研究人员推测可能是P53通过调控miR-29间接调节LINP1的转录[19]（图1）。另外,研究人员还发现用新制癌菌素、依托泊苷、博来霉素处理U2OS细胞后,转录调控因子E2F1与ANRIL基因的启动子结合增加,从而促进了lncRNAANRIL的转录[20]（图1）。这些研究均表明DNA损伤发生之后,细胞在应答DNA损伤时,许多lncRNA的转录发生了变化,某些lncRNA的转录变化就是DDR的组成部分,但是哪些lncRNA参与了DDR、在DDR中起了何种作用还有待进一步的研究。

2 lncRNA通过不同的途径参与DDR

细胞应答DNA损伤时,转录发生变化的部分lncRNA通过不同的方式参与DDR,如调节DDR功能因子的表达、参与DDR中的信号传递或直接调控DNA修复过程。

2.1 lncRNA通过调节DDR功能因子的表达来参与DDR

已知的DDR功能因子绝大多数是蛋白质,根据其在DDR中发挥的作用可分为感应因子、传递因子和效应因子三类[21]。感应因子是能识别异常DNA结构并激活上游激酶的一些蛋白质,如PARP1、MRE11/RAD50/NBS1等;传递因子主要是蛋白激酶级联反应中的一些蛋白质,如ATM（ataxia telangiectasia mutated）、ATR（ataxia telangiectasia and Rad3 related）以及DNA-PK（DNA-dependent protein kinase）等;效应因子r是参与DDR的蛋白激酶底物和修复DNA损伤的蛋白质,这些因子直接参与DNA复制、DNA修复、细胞周期控制和凋亡等过程,如P53、E2F1等[21,22]。

研究表明lncRNA可以通过调节DDR中不同功能因子的表达来参与DDR。lncRNACRNDE作为miR-136的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）,以诱饵的方式吸附miR-136并与其结合,减少miR-136与E2F1 mRNA的结合,进而促进转录因子E2F1的表达,后者可增强结直肠癌细胞对奥沙利铂（一种铂类抗癌药）的耐药性,减少DNA损伤诱导的细胞凋亡[23]。lncRNABARD1 9,L同样以ceRNA方式发挥功能。它由BARD1基因第9个内含子转录而来,BARD1 mRNA包含多个剪切异构体,参与了多种细胞过程如DNA修复、转录调控、染色质重塑等。BARD1 9,L与具有蛋白质编码功能的BARD1 mRNA共享部分3,-UTR区域,能竞争性地与miR-203和miR-101结合,而miR-203和miR-101能与BARD1 mRNA结合,因而BARD1 9,L抑制了miR-203和miR-101对BARD1 mRNA的负调控作用[24]。另外,研究发现在DDR过程中细胞周期调控因子CCND1的表达受到抑制。当电离辐射使DNA发生损伤后,lncRNACCND1会在CCND1基因的启动子处被启动转录,随后它将与组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase,HAT）抑制剂TLS（translocated in liposarcoma）结合并定位到CCND1基因的调控区域。TLS的N末端可以与CBP（CREB-binding protein）和p300结合,从而抑制CBP/p300-HAT复合物的活性,最终抑制CCND1基因的表达[25],从而导致细胞周期停滞（图1）。lncRNATODRA由RAD51上游69 bp处反向转录而来。RAD51是DSB（double-strand break）修复及同源重组修复中的修复因子,也是DDR中重要的功能因子,其表达失调会导致基因组的不稳定,从而引发癌症。TODRA与RAD51由同一个启动子启动转录,该启动子区域包含一个E2F1结合位点,双向调控TODRA与RAD51的表达;在癌细胞中,TODRA会促进TPIP（TPTE家族的一员,编码PTEN相关的酪氨酸激酶）的表达,而TPIP会与E2F1相互作用诱导RAD51的表达[26]。此外,lncRNA还能通过调节DDR中的某些功能因子来催化DDR中组蛋白的修饰。Wan等[27]发现DNA损伤会诱导组蛋白H4第5位、第8位、第12位赖氨酸发生乙酰化,这种乙酰化主要受jade1-HBO1复合物催化,而lncRNAJADE可以作为一个支架分子招募CBP/p300和BRCA1蛋白,进而激活jade1基因的转录（图1）。

2.2 lncRNA参与DDR的信号传递

DDR网络包含了一系列激酶级联反应。在已知的激酶应激网络中,ATM、ATR以及DNA-PK这3种激酶被认为是DNA损伤确认后细胞应答的发起者,它们分别拥有数百种蛋白质底物,可以使靶标蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基发生磷酸化修饰,进而激活靶标蛋白质,如P53、BRCA1等,而P53和BRCA1这些蛋白质又调控许多DDR功能因子的转录,从而形成复杂的信号传递网络[28]。ATM-P53信号通路是DDR反应的主要通路之一。研究发现部分lncRNA能通过调节P53信号通路,进而调控DDR中细胞周期的进程等,如基因间区长链非编码RNA（large intergenic ncRNA,lincRNA）LIRR1。在细胞经电离辐射后,LIRR1会引起P53活化进而诱导p21表达,抑制细胞周期依赖性激酶2（cyclin-dependent kinase 2,Cdk2）,导致细胞周期停滞在G1期,从而参与和调控P53介导的DDR通路[29]。有研究发现,lncRNAROR的转录在结直肠癌细胞中显著升高,而敲降lncRNAROR会引发G0/G1的细胞周期停滞,促进细胞凋亡,从而显著抑制细胞增殖和生存能力。进一步研究证实lncRNAROR与核内不均一核糖核蛋白Ⅰ（heterogeneous nuclear ribonucleoproteinⅠ,hnRNPⅠ）相互作用,从而显著降低DNA损伤诱导的P53表达,进而抑制DDR中P53介导的信号通路[30]（图1）。DNA损伤诱导产生的另一种lncRNADINO在细胞应答DNA损伤时会与P53结合,稳定P53蛋白活性并促进P53调控的靶基因表达,从而调节P53介导的DDR反应[31]。而lincRNA-p21与hnRNP-K （heterogeneous nuclear ribonu cleoprotein K）结合,通过调控hnRNP-K的定位,抑制P53下游部分基因的表达来调控P53介导的信号通路,从而诱导细胞凋亡[15]（图1）。此外,研究发现lincRNA-p21能通过与MDM2（一种E3泛素连接酶）结合减少MDM2对P53的抑制作用,增强p300与P53的相互作用 （p300使P53乙酰化）,进而增强P53的转录活性[32]（图1）。

lncRNA还可以与DDR信号传导中的其他功能因子相互作用,调控信号传递结果来参与DDR。当用阿霉素处理成纤维细胞时,lncRNAPANDA通过诱捕核转录因子NF-YA（一个DDR的功能因子）来阻止后者与靶基因的结合,从而抑制NF-YA对凋亡基因的激活[33]（图1）。gadd7是一条长754个核苷酸的多腺嘌呤lncRNA,其过表达会抑制细胞的生长。相关研究报道,紫外照射仓鼠卵巢细胞后,lncRNAgadd7的转录发生显著变化。进一步研究显示,紫外照射诱导产生的gadd7直接与TAR（DNA结合蛋白）相结合,干扰TAR与细胞周期蛋白依赖性激酶6（cyclin-dependent kinase 6,Cdk6）mRNA的相互作用,导致Cdk6 mRNA的降解,使细胞停滞在G1期,让细胞有足够时间修复DNA损伤并防止细胞在修复DNA损伤前进行DNA 复制[34]（图 1）。

2.3 lncRNA直接调控DNA损伤的修复过程

DNA损伤修复是将受损的DNA恢复正常,维持遗传信息相对稳定的过程,是维持生命稳定存在的重要保证。由于许多因素都能损伤DNA,因此DNA损伤类型种类繁多。针对不同的DNA损伤类型,DNA损伤修复机制大致可分为以下几种:核苷酸切除修复（nucleotide excision repair,NER）、碱基切除修复（base excision repair,BER）、双链断裂修复[包括同源重组（homologous recombination,HR）修复和非同源末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）修复]、错配修复（mismatch repair,MMR）、DNA 链间交联修复（interstrand crosslink repair,ICL repair）以及直接修复（direct repair）等[35]。

研究发现lncRNA能直接调控DNA损伤的修复。如:当DNA发生双链断裂损伤后,受ATMNF-kB通路调控,细胞受激转录出 lncRNADDSR1。随后DDSR1通过与BRCA1、hnRNPUL1相互作用,募集BRCA1和RAP80进入到断裂的DNA末端,调控断裂DNA末端的切除,从而促进DNA双链断裂损伤通过HR通路修复[36]（图1）。而lncRNALINP1在DNA发生双链断裂损伤后,可以通过分子支架的形式连接Ku80与DNA-PKcs形成修复复合物,即5,结构域连接Ku80,3,结构域连接DNA-PKcs,从而启动NHEJ修复通路,实现DNA损伤修复[37]（图1）。

3 lncRNA在基因组稳定性中发挥作用

基因组的不稳定性是癌症发生的重要因素,除了DNA序列的突变,还包括染色体的重排与染色体的非整倍性等。Lee等[38]在用阿霉素处理结直肠癌细胞后,发现了一条依赖P53通路激活的非编码RNA,将其命名为NORAD。进一步研究证实当用阿霉素处理细胞使DNA受到损伤后,NORAD将作为诱饵捕获PUMILIO蛋白并与其结合,减少PUMILIO蛋白对有丝分裂、DNA复制、DNA损伤修复等相关靶mRNA的抑制作用,从而使细胞的有丝分裂正常进行,维持了染色体的整倍性（图1）。端粒在保持染色体的完整性和控制细胞生长等方面起着至关重要的作用,而端粒蛋白复合体组分TRF2丢失会使端粒功能失调,导致染色体融合而改变染色体的整倍性。研究表明在TRF2缺失的细胞中,lncRNATERRA的转录会上调,且通过UUAGGG重复序列与SUV39H1组蛋白甲基转移酶的N端结构域相结合,增加甲基化的H3K9在受损端粒的积累,进而促进端粒末端的融合,影响基因组的稳定性[39,40]（图1）。

4 结语和展望

综上所述,lncRNA可能在DDR中扮演了许多重要的角色,发挥着关键作用,只是目前知之甚少。

一方面在应对DNA损伤时,许多lncRNA的转录会发生变化,目前确认功能的仅仅是极少的一部分。Nie等[41]发现在用X射线处理人支气管上皮细胞后有115条lncRNA的表达上调,通过生物信息预测,它们可能参与了P53信号通路,然而其具体的功能及作用机制还有待进一步研究。Cd会引发DNA损伤、降低DNA修复能力并促进细胞凋亡,Zhou等[42]用CdCl2处理人支气管上皮细胞后发现有369条lncRNA表达上调,90条lncRNA表达下调,其中仅证实lncRNAENST00000414355被敲降后,会抑制损伤细胞的生长、下调DNA损伤相关基因的表达并上调DNA修复相关基因的表达。

另一方面已知功能的lncRNA能通过多种途径参与DDR的多个过程,说明可能在DDR的各个环节中都有lncRNA参与。此外,lncRNA失调与缺陷的DDR都与多种疾病的发生发展相关,因此越来越多lncRNA的功能被挖掘,必将丰富我们的治疗手段、提高治疗的效率、获得更多有效的药物。

总之,深入揭示lncRNA在DDR中的功能和其参与DDR的分子机理,不仅能深化和丰富DDR的理论知识,而且能极大加深我们对与之相关疾病发病机理的理解,更能在理论上指导临床治疗和药物研发。