人用H5N1禽流感疫苗临床研究进展

王月琦 （北京师范大学亚太实验学校 北京 102209）

禽流行性感冒（禽流感）是由禽流感病毒引起的一种禽类烈性传染病。禽流感病毒的某些亚型毒株会感染人类而引起急性呼吸道传染病，称为人感染禽流感（人禽流感）。与普通流行性感冒（流感）相比，人禽流感致病性强，致死率高，且缺乏有效的疫苗控制预防。

H5N1 亚型禽流感病毒具有高致病性，可感染人类。人感染H5N1 禽流感病毒后伴有严重的并发症，致死率高达60%以上。自从1997年在香港首次发现H5N1 禽流感病毒由家禽传染人类的病例以来，全世界多个国家和地区均出现确诊病例，H5N1 流感病毒呈现出世界性分布态势。泰国一例母亲与儿童之间的传播加剧了人们对H5N1 禽流感大流行爆发的担忧。因此对于H5N1 禽流感的防治一直是相关科研工作者研究的重点。

接种疫苗是预防禽流感病毒传播的有效方法，可以大大降低发病率和死亡率。目前市场上常见的人用禽流感疫苗主要是全病毒灭活疫苗和裂解疫苗。然而这2 种疫苗都是由鸡胚中培养产生的病毒株制备而成，制备工艺复杂耗时长，难以满足禽流感大流行时人们对疫苗的大量需求；疫苗成分复杂，有卵清蛋白等物质的残留，对蛋类过敏的人群不适合接种这2 类疫苗。另外，野生型H5N1 高致病性流感病毒毒力较强，会对活性的鸡胚产生破坏，不适合采用上述传统方式制备H5N1流感疫苗，因此，开发新型的人用H5N1 禽流感疫苗制备技术成为研究热点。本文综述现阶段各国家的人用H5N1 禽流感疫苗进入临床研究及临床审批情况的相关进展，并介绍各类型人用禽流感疫苗的临床数据及关键技术，可为人用禽流感疫苗或其他针对高致病性病毒的疫苗研发提供参考依据。

1 禽流感灭活疫苗

灭活疫苗是在鸡胚中培养并收集纯化流感病毒，用甲醛溶液或β-丙内酯灭活得到。根据灭活纯化工艺的不同，灭活疫苗又分为全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗；根据选择的毒株的不同，可以分为自然分离株灭活疫苗和重配病毒株灭活疫苗。

1.1 H5N1 病毒株的选择 野生型H5N1 流感病毒具有高致病性，会对鸡胚的活性产生严重危害，鸡胚培养难以获得足够量的病毒生产疫苗。为攻克这一技术难题，研究人员采用反向遗传技术构建了重配H5N1 病毒株，提高了毒株的安全性及在鸡胚中的生长能力。这些重配病毒株保留了H5N1 流感病毒HA 与NA 的抗原性，同时加入了高产流感株A/Puerto Rico/8/34（H1N1；PR8）的相关基因。PR8 流感病毒对人体无致病性，且在鸡胚中易于生长，PR8 毒株已被用来生产H1N1 和H3N2 等季节性流感疫苗。目前世界卫生组织（WHO）推荐的重配H5N1 病毒株主要是英国国家生物品标准化与检定研究所（NIBSC）研发的NIBRG-14 （A/Vietnam/1194/2004-A/PR/8/34） 流 感病毒毒株。

1.2 全病毒灭活疫苗 H5N1 全病毒灭活疫苗已被批准生产应用。在我国，北京科兴生物制品有限公司采用NIBRG-14 毒生产了H5N1 禽流感全病毒灭活疫苗，疫苗以氢氧化铝作为佐剂，血凝素（HA）含量为10 滋g/0.5 mL /支，在2008年获得了国家食品药品监督管理总局（SFDA）的生产批件。该疫苗适用于18～60 岁人群的预防接种，免疫后42 d 志愿者血清阳转率达到78%，抗体指标均达到欧盟人用医药产品委员会（CHMP）发布的流感疫苗的免疫标准［1］；并且，交叉免疫研究结果显示： 临床试验用的越南株疫苗对于安徽株和印尼株具有较好的交叉免疫反应。

匈牙利Omninves 公司生产的H5N1 全病毒流感疫苗同样以NIBRG-14 为生产毒株，每针剂含有HA 6 滋g/0.5 mL，并采用AlPO4为佐剂，以单针剂的全病毒灭活疫苗接种志愿者（146 人，＞18 岁），血清保护率约有68%［2］。该疫苗获得匈牙利批准生产，但由于该公司未提供详细数据未获得欧盟审批许可。

在安全性评价中发现，H5N1 全病毒灭活疫苗的常见的不良反应是注射部位红肿疼痛，全身乏力等，这与疫苗制备过程中引入的杂质（卵清蛋白、裂解剂和硫化汞等）有关，一般适用人群为18～60岁对鸡蛋无过敏史、非妊娠期的成人。由于全病毒灭活疫苗如果灭活不彻底具有潜在的致病性，生产过程中需要谨慎评估疫苗的抗原反应性。

1.3 裂解疫苗与灭活型亚单位疫苗 与全病毒灭活疫苗相比，裂解疫苗引起的副反应较小，具有较高的安全性。裂解疫苗是利用乙醚等裂解剂去除流感病毒中的脂类成分，保留病毒的所有蛋白成分，病毒的颗粒结构和单链RNA 几乎丢失，因此裂解疫苗的固有免疫原性也相应减小，接种一般需要2 针剂免疫，且需要提高抗原用量或加入佐剂增强疫苗的抗原性。流感裂解疫苗制备相对简单，已被广泛应用于三价季节性流感疫苗中，人用H5N1 禽流感裂解疫苗也已被批准生产。

赛诺菲巴斯德研究所以NIBRG-14 为毒株生产出H5N1流感裂解疫苗，临床试验显示［3］，2 针高剂量的抗原HA（90 滋g）含量诱导产生更高水平的血清抗体，加入铝佐剂组后，保护性抗体显著提高。赛诺菲巴斯德研究所在二免6 个月后又进行了第3 次免疫，结果发现抗体滴度大大提高，然而考虑到流感大流行时的时间与经济问题，3 次免疫并不是合适的免疫策略。2007年4月，赛诺菲巴斯德研究所生产的含抗原HA 90 滋g 的剂型（不含佐剂）通过FDA 批准，适用人群为18～64 岁的健康人群。英国葛兰素史克（GSK）公司也发现低于90 滋g HA 的抗原剂量难以达到免疫保护效果［4］。然而该剂量是常规季节性流感疫苗剂量的6 倍，现有的传统疫苗生产力在流感流行期间难以满足疫苗用量需求。

澳大利亚CSL 公司生产的H5N1 裂解疫苗在2008年6月在澳洲注册成功。临床试验为30 滋g和45 滋g HA 含佐剂组受试人群包括6 个月～9 岁的健康婴儿和儿童、18～64 岁健康成人和大于65岁的健康老人，结果发现6 个月～9 岁的婴儿和儿童组产生较好的免疫反应［5］。但由于巴斯德所被批准的H5N1 裂解疫苗的存在，CSL 公司的裂解疫苗在随后的FDA 注册中未能通过。

灭活流感亚单位疫苗是在裂解疫苗的基础上经过分离纯化制备而成，主要成分是HA 与NA等抗原蛋白，抗原纯度高，疫苗成分简单，安全性好。与流感裂解疫苗相似，亚单位疫苗的免疫原性较弱，应用时同样需要加入佐剂，且生产成本较高。瑞士诺华（Novartis）公司的临床试验，试验以氢氧化铝和水包油乳剂MF59 为佐剂［6］。结果发现，7.5 滋g HA 的疫苗剂量辅以MF59 所诱导的抗体反应最强，血清阳转率为73%；而铝佐剂组即使HA 含量上升至30 滋g 时，志愿者的血清阳转率也仅为14%。同样，英国GSK 公司发现油乳佐剂AS03 对H5N1 灭活疫苗的免疫原性提高效果也远优于铝佐剂［7］。

以上临床试验结果中可以发现，H5N1 禽流感病毒中血凝素H5 的免疫原性远弱于其他类型的流感病毒，因此加入安全有效的佐剂以提升灭活型H5N1 疫苗制剂的免疫原性成为科研工作者的研究热点。

1.4 基于细胞培养的流感灭活疫苗 鸡胚培养的流感疫苗制备工艺复杂、周期长且产量有限，在流感大流行期间难以迅速生产大量疫苗。因此，相关科研人员尝试寻找新的策略生产流感疫苗。以细胞培养代替鸡胚培养可以缩短疫苗生产周期，在生产过程中易于控制质量参数，更有利于大规模生产疫苗，同时可以解决鸡胚培养时卵清蛋白残留带来的问题，所生产的疫苗可以用于对鸡蛋过敏人群的接种。目前马犬肾细胞系（Madin－Darby canine kidney cells，MDCK）和非洲绿猴肾细胞系（African green monkey Vero cells，Vero）在荷兰已经得到许可生产流感疫苗。而在世界范围内只有Vero细胞可用于疫苗生产。美国百特（Baxter）公司［8］采用Vero 细胞培养生产的H5N1 全病毒灭活疫苗（VepacelR）已经进行了Ⅲ期临床试验，发现受试者疫苗保护率显著高于鸡胚培养的流感疫苗受试者，并且疫苗的安全性与耐受性均提高，该疫苗于2012年获得欧盟批准上市。

鸡胚培养生产疫苗具有有效、安全、产量较高等优势，然而在生产新的疫苗之前，需要对病毒种子进行筛选，并不是每种病毒株都适合鸡胚培养。另外，鸡胚培养的周期较长，在流感大流行时期可能无法及时满足疫苗需求。细胞培养生产的疫苗周期短，但扩大生产需要重新优化工艺，小量生产时的工艺条件不适用于大的发酵罐，另外细胞培养容易偶发污染，造成资源浪费，因此近些年有些厂家放弃了细胞培养回归到鸡胚培养。总体来讲，两者成本及生产的疫苗质量不相上下，然而对于发展中国家，在鸡胚培养上进行重点投资比较合适。

2 减毒活疫苗

为了提高疫苗的免疫原性、降低抗原用量，研究人员开发了生产成本低、 周期短的冷适应性流感减毒活疫苗。冷适性减毒活疫苗保留了流感病毒的部分抗原活性，通过模拟病毒的自然感染途径刺激机体，可以诱导产生长效免疫反应。通过滴鼻或喷鼻接种人群后，减毒活疫苗可以有效诱导机体产生黏膜性sIgA 抗体，并能诱导较好的细胞免疫反应，具有一定的交叉保护能力。然而减毒活疫苗也存在很多需要克服的问题：1）由于病毒在鼻咽部的复制，减毒活疫苗引起的常见不良反应包括鼻塞、头痛、肌肉疼痛或发热；2）减毒活疫苗存在毒力回复的可能，需要对其生物安全性进行充分验证；3）出于安全性考虑，减毒活疫苗不能应用婴儿或老年人等高危人群；4）为防止新的HA 和NA 的基因插入人类基因组，减毒活疫苗只能在已知病毒株流行期间应用；5）基于鸡胚培养的生产方法限制了减毒活疫苗的生产力。

Karron［9］等制备了H5N1 流感减毒活疫苗，在临床试验中该疫苗的安全性得到了验证，H5N1 减毒活疫苗在鼻腔中的复制十分有限，毒性明显弱于季节性流感减毒活疫苗。临床前实验表明，2 次鼻腔免疫H5N1 减毒活疫苗可以有效抑制同型或异型流感病毒的复制生长，为机体提供交叉保护力。然而，在临床实验中［10］，该疫苗的保护效果并不理想，经仅11%的志愿者体内检测到具有保护性的抗体，这可能与疫苗毒性过低有关。

俄罗斯也批准了一例人用H5N2 流感减毒活疫苗［11］，临床试验中血清阳转率为47%～55%，对以反向遗传技术制备的重配H5N1 流感病毒株具有交叉保护力，保护率约为29%～31%。该疫苗可以有效诱导鼻腔黏膜分泌抗体，并可提高志愿者外周血中的CD4 和CD8 效应/记忆性T 细胞的水平。

3 重组亚单位疫苗

流感重组亚单位疫苗（recombined HA，rHA）是将流感病毒的抗原蛋白（主要是血凝素HA）的基因载入杆状病毒系统通过表达、纯化制备而成。所采用的表达系统包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、大肠埃希菌、 酵母和植物等。重组亚单位疫苗中HA 是否能够正确折叠、 是否能够保持稳定性和免疫原性是关键所在。

最早制备的H5 重组亚单位疫苗是美国Protein Sciences 公司利用昆虫细胞表达载有H5 基因的杆状病毒系统制备了重组H5 疫苗（PanBlokR），采用的种子病毒是重组A/Hong Kong/97 病毒株。科研人员发现HA 主要以三聚体的形式存在，小部分裂解为HA1 与HA2 片段。该疫苗粒径在30～40 nm之间，形成一种玫瑰花结构的寡聚物，目前已完成Ⅰ期与Ⅱ期临床试验［3，12］。免疫结果显示，未加入佐剂时，免疫效果并不理想；以含有吡喃葡萄糖基脂（GLA）的稳定乳液（GLA-SE）作为佐剂时，明显降低疫苗用量，提高志愿者的血清阳转率等，达到美国FDA 的批准要求。

美国Fraunhofer 公司［13］通过烟草植物表达H5蛋白制备了重组亚单位疫苗。基于植物表达的生产方式快捷经济，替代了以细胞培养为基础的疫苗制备方式，所制备的亚单位疫苗安全性良好，在临床前实验中可以有效诱导小鼠和雪貂产生HI抗体和中和抗体。然而，临床试验表明，基于该亚单位疫苗免疫原性低于以细胞培养为基础重组亚单位疫苗，说明H5 蛋白可能没有正确折叠。VaxInnate 公司利用大肠埃希菌表达HA 的球状头部HA1 与鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛2 型（STF2）的融合蛋白（VAX161）。鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛素中含有Toll 样受体5 的结合位点，可以提高HA 的免疫原性。临床试验结果发现志愿者经过2 针剂1.5-2.5 μg HA（低剂量）的疫苗免疫后，所产生的血清保护率为49%［14］。

4 病毒样颗粒疫苗

流感病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）疫苗是将流感病毒的抗原基因（如HA、NA、M1 或M2的基因）克隆到杆状病毒系统内，经过细胞表达后自组装制成。病毒样颗粒可以模拟病毒的免疫原性，能够有效诱导机体产生体液与细胞免疫［15］。并且病毒样颗粒不含病毒基因组和相关抗原蛋白，不能在细胞内复制，不具有感染性，可重复给药，适用人群广泛。

VLPs 流感疫苗已被证明可以同时提高CD4+T 和CD8+T 细胞免疫反应，可以提供针对变异病毒的交叉保护力［16-17］。有研究对比了H5N1 VLPs疫苗与H5N1 重组HA 疫苗在小鼠体内的免疫效果。结果发现，VLPs 诱导更高水平的血凝抑制抗体，且提供小鼠针对异株H5N1 病毒的交叉保护力，在异株病毒攻毒试验中没有发生个体死亡现象［17］；而重组HA 亚单位疫苗组出现了一定程度的致病致死率。在与H5 全病毒灭活疫苗的对比中，VLPs 同样显示出优越的疫苗保护效果［18］。

美国Novavax 公司［19］将载有H5N1 病毒HA、NA 和M1 基因的杆状病毒感染昆虫细胞制备VLPs 流感疫苗。临床试验中选择HA 含量分别为15 μg、45 μg 和90 μg 的疫苗制剂对18～40 岁健康人群进行2 针剂注射免疫，志愿者的血清阳转率分别为40%、57%与61%，均能达到审批标准，而且该疫苗具有针对H5N1 土耳其株和安徽株流感病毒的交叉保护力。与重组亚单位疫苗相似，VLP 也可通过植物生长制备而成。加拿大Medicago 公司利用烟草植株表达基于流感病毒HA的病毒样颗粒疫苗，以氢氧化铝作为佐剂进行了临床研究。结果发现疫苗所诱导的血清阳转率分别为58%与57%，达到审批标准，但是血清保护率未达标。

5 DNA 疫苗

DNA 疫苗又称核酸疫苗、基因疫苗，是继巴斯德开创的减毒疫苗、 基因工程疫苗之后的第3代疫苗。DNA 疫苗实质是基因免疫，是指将含有编码外源性蛋白基因的真核表达质粒DNA 直接接种到机体后，通过宿主细胞的转录翻译系统合成抗原蛋白，诱导机体产生特异性细胞和体液免疫应答的一种新型的免疫策略。与传统的灭活疫苗、减毒疫苗相比，DNA 疫苗的制备简单迅速，稳定性高且储存方便，无复制性，无感染性。目前，DNA 免疫已成为防治传染病、肿瘤以及移植免疫治疗的研究热点。DNA 免疫与病毒自然感染诱导的免疫应答十分相似，能同时诱导细胞免疫和体液免疫。

基于HA、NA 基因的流感DNA 疫苗主要诱导体液免疫反应，基于NP 和M1 基因的DNA 疫苗倾向于诱导细胞免疫反应，并且可能提供交叉保护力。流感DNA 疫苗已经在小鼠、雪貂、灵长类动物以及一些临床试验中证实了有效性。

美国Vical 公司的研发人员［20］制备了基于H5的单价DNA 疫苗和基于H5、NP 和M2 的三价DNA 疫苗，以VaxfectinR为佐剂在18～45 岁健康人群中进行了临床实验。VaxfectinR是基于阳离子性脂质体的悬浮液，既可作为蛋白类疫苗的佐剂又可作为DNA 疫苗的佐剂。经过验证，该疫苗制剂耐受性好，局部和系统性的不良反应与普通蛋白类疫苗相似。临床试验结果显示单价DNA 疫苗的血清阳转率为47%～67%，在诱导抗体反应方面优于三价DNA 疫苗且与蛋白类流感疫苗水平相当。另外，这2 种DNA 疫苗都可以诱导显著的T细胞反应（75%～100%），并且可以提供针对H5N1病毒香港株和土耳其株的交叉保护力。这是首例证明基于H5 的DNA 疫苗可以诱导与灭活亚单位疫苗水平相当的临床试验，为开发人用H5N1流感疫苗的提供了新的策略。

美国国家卫生研究院［21］开展了临床试验研究基于H5 的DNA 疫苗联合H5N1 单价灭活亚单位疫苗的免疫效果。研究发现DNA 疫苗的加入可以大大提高志愿者的抗体反应水平，并且DNA 疫苗与亚单位疫苗接种时间间隔越长，血清阳转率越高（间隔4 周时，血清阳转率仅为27%）。但是，在接种亚单位疫苗前接种2 次DNA 疫苗并不能显著提高抗体反应水平。除此之外，DNA 疫苗的加入还大大提高了中和抗体的滴度，可以诱导机体产生范围更广的免疫保护力。分析其原因可能是，DNA 疫苗可以提高辅助性T 细胞的数量，促进CD4 细胞的分化，因而提高B 细胞的增殖。

6 重组活载体疫苗

经过基因改造后的一些病毒（腺病毒、痘病毒等）或细菌（沙门氏菌、大肠杆菌等）对宿主毒性较低，不具备传染性，可以在宿主细胞内进行高水平的基因表达，并且不会插入宿主细胞基因组，是较为理想的外源性基因载体。有学者将H5N1 流感病毒的H5 基因插入具有复制缺陷的腺病毒载体中制备出H5N1 活载体疫苗，并且发现免疫1次即可诱导小鼠和雪貂体内产生有效的体液免疫和细胞免疫反应，并且显示出针对异株流感病毒的交叉保护能力［22］。重组活载体疫苗可以诱导长效免疫反应，不需要佐剂，抗原用量少。

美国的疫苗生产商PaxVax 在18～40 岁的健康人群中进行了基于H5 的病毒活载体疫苗（PXVX0103）的Ⅰ期临床试验［23］。免疫剂量从107逐渐上升到1011个病毒颗粒，免疫程序为在1 d、6 d、114 d 对志愿者口服给予病毒活载体疫苗，口服给药的3～12月后肌肉注射接种90 μg HA 的亚单位疫苗进行加强免疫。结果发现，活载体病毒疫苗在宿主之间不具备传染性，安全性得到验证。只口服活载体病毒疫苗可以诱导细胞免疫反应的发生，然而抗体反应很弱，志愿者血清转染率仅为11%；而在志愿者接受107或108个病毒颗粒口服免疫后，再肌肉注射接种亚单位疫苗加强免疫，血清阳转率大大提高，分别为69%和78%；当以1011活载体疫苗进行口服初免再肌肉注射接种亚单位疫苗时，志愿者血清阳转率达到100%。H5N1 活载体病毒疫苗联合亚单位疫苗的接种方式还诱导出显著的细胞免疫反应，并产生了针对异株H5N1病毒的交叉保护力。PaxVax 公司计划继续开展PXVX0103 的Ⅱ期临床试验。

7 结论与展望

综上所述，每种疫苗类型都有各自的优、缺点。灭活型裂解或亚单位疫苗安全性高，生产工艺成熟，适用人群范围广，有利于临床报批，然而免疫原性较低，常需要加入佐剂增强其免疫效果，降低抗原用量。全病毒灭活疫苗同样生产程序成熟，且所需抗原用量相对裂解疫苗较低，但是安全风险增大，且成本较高。减毒活疫苗免疫原性强，只需一次免疫即可达到免疫保护效果，不需要佐剂，然而其毒力回复的可能性限制了它的应用，只允许在某种流感病毒大流行时使用，且适用人群较窄，不适用于老人与儿童。

许多新型人用H5N1 禽流感病毒疫苗正在积极研发，研究人员开发了诸如基因工程疫苗、DNA疫苗等新型流感疫苗，以缩短生产周期，扩大生产量，降低疫苗的副反应并增强免疫保护效果，有些已经进入临床研究阶段。然而，出于对安全性的慎重考虑，这些新型疫苗被批准使用还需时日。另外，佐剂的研究会在很大程度上推进疫苗的发展。随着疫苗生产技术以及工业基础的发展，有理由相信在不久的将来会研究出免疫原性更高、 安全性更好的人用禽流感疫苗。