胶原/壳聚糖复合纳米纤维膜引导骨再生的细胞学研究

李晓静 高 波 董 研* 苟中入 苗滪汶

1(浙江大学医学院附属第二医院口腔矫形科，杭州 310009) 2(浙江大学医学院附属儿童医院口腔科，杭州 310006) 3(浙江大学浙江加州国际纳米技术研究院，杭州 310029)

引言

骨组织工程中生物支架的性能至关重要。近年来纳米材料的发展促进了纳米结构生物支架的研究，由于其类似天然细胞外基质的结构，刺激组织细胞生长及促进组织细胞分化的效能较传统支架优越，因而广受学者关注[1-2]。

静电纺丝技术是将高分子材料或者少数无机材料在高压静电场中形成较细的表面带电的喷射流，经溶剂蒸发及熔体冷却干燥后形成纳米纤维[3-4]。胶原和壳聚糖都是天然生物聚合物，均具有良好的生物相容性、可降解性及优良的生物学性能，在生物支架的制备中广受关注；同时，聚环氧乙烯(PEO)是高分子的聚合物，能为胶原和壳聚糖分子链提供彼此缠绕的轴，可改善胶原和壳聚糖的纺丝性质，已被广泛用于临床医药领域[5-6]。已有学者采用静电纺丝技术将胶原和壳聚糖制备成纳米纤维支架，用于皮肤、血管、神经、骨和软骨等组织工程领域的研究[7-9]。但这些研究中，胶原和壳聚糖的溶剂大多使用了一些生物相容性较差的有机溶剂，如六氟异丙醇、三氟乙酸或二氯甲烷等，已有研究发现，这些有机溶剂对于组织细胞的生长不利[10-12]。

因此，本研究拟采用水溶性的乙酸为溶剂，以PEO为增塑剂，通过静电纺丝技术制备胶原/壳聚糖纳米纤维膜，以研究其作为骨再生生物膜的细胞相容性及诱导成骨性。

1 材料和方法

1.1 实验材料

I型胶原，相对分子质量0.8-1.0×105，四川铭让生物科技有限公司；壳聚糖，中分子量(MW190 000-310 000)，Sigma； 聚环氧乙烯(PEO，分子量700 KDa)、2.5%戊二醛，国药集团；冰醋酸，阿拉丁试剂有限公司；甘氨酸，上海生物工程技术有限公司；DMEM细胞培养基、2.5 g/L胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(PBS)、丙酮、无水乙醇，杭州吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清(Gibco)，美国；碱性磷酸酶试剂盒，南京建成生物制剂有限公司；羟脯氨酸测试盒，南京建成生物制剂有限公司；罗丹明标记的鬼笔环肽(Invitrogen)，美国；Alexa fluor 594标记的骨钙素(Sigma)，美国；细胞核染色剂DAPI (Sigma)，美国；茜素红S(Sigma),美国。

1.2 实验方法

1.2.1静电纺丝纳米纤维膜的制备

静电纺胶原/聚环氧乙烯纳米纤维膜的制备：以45%乙酸溶液配制质量分数7%的胶原溶液，以水为溶剂配置7%的PEO溶液，两者以质量比4∶1配置成混合溶液。电纺过程中采用钝口22 G医用针头，溶液置于20 mL注射器中，采用医用注射泵控制流速0.1 mL/h，电压12 kV，接收装置距离为12 cm，制备胶原纳米纤维膜(COL)。

静电纺胶原/壳聚糖/聚环氧乙烯复合纳米纤维膜的制备：将上述胶原、PEO溶液及3%壳聚糖乙酸溶液按质量比5∶1∶4、5∶2∶3、5∶4∶1混合，在相同的电纺条件下分别制备胶原/壳聚糖复合纳米纤维膜-1(COL/CHI-1)，胶原/壳聚糖复合纳米纤维膜-2(COL/CHI-2)，胶原/壳聚糖复合纳米纤维膜-3(COL/CHI-3)。

将制备的四种纳米纤维膜置于37℃恒温箱内干燥48 h取出，浸入75%乙醇溶液中，在密闭容器内2.5%戊二醛溶液交联4 h后，浸入0.2 M甘氨酸溶液中封闭醛基，去离子水漂洗后干燥备用。

1.2.2扫描电子显微镜观察

将交联前后的4种纳米纤维膜裁剪出表面积5 mm×5 mm的测试样本，固定样本盘中，表面喷金后通过扫描电子显微镜观察膜的表面形态。使用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics,Inc, USA)测量纳米纤维的直径，计算其平均值。将COL组及COL/CHI组中纳米纤维表面光滑、无液滴状的一组作为实验组。

1.2.3细胞培养与接种

大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)购于上海妙通生物科技有限公司，采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5%的CO2培养箱中常规方法培养，每24 h更换培养液，分离传代备用。2.5 g/L胰蛋白酶消化单层培养细胞，离心、悬浮、血细胞计数板计数，将细胞悬浮液接种至细胞培养板(空白对照组，TCP)及铺有消毒过的COL纳米纤维膜、COL/CHI复合纳米纤维膜上继续培养。细胞分化实验在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中加入了成骨细胞诱导剂，10 mM β-甘油磷酸酯，0.1 μM地塞米松和0.2 mM抗坏血酸溶液。

1.2.4MTT法检测细胞黏附与增殖

将BMSCs单层细胞接种于24孔细胞培养板的膜材料上，以细胞培养板为空白对照组，每组设6个复孔，通过MTT法检测BMSCs在两组复合纳米纤维膜上的黏附及增殖情况。每孔接种细胞5×104个，加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5%的CO2培养箱中培养。于时间点1、4、7 d检测细胞黏附和细胞增殖情况。在每个时间点将培养液吸出，PBS洗3遍，换用1 mL新鲜无血清培养基，加入100 μL MTT继续培养4 h，弃原培养液，每孔加入400 μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min，吸取上清液在490 nm波长下用酶标仪测各孔的OD值，取平均值。

1.2.5碱性磷酸酶检测诱导细胞成骨性

将BMSCs单层细胞接种于48孔细胞培养板的膜材料上，以细胞培养板为空白对照组，每组设6个复孔，细胞接种密度为1×104个/孔，第二天细胞培养液换成含成骨细胞诱导剂的培养液，共培养7、14 d后，PBS冲洗三次，每孔加入200 μL的10% Triton-X100溶液裂解细胞，4 ℃条件下孵育12 h，用碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒测定裂解产物中酶的活性，选择490 nm波长测定溶液的吸光度。用BCA方法测定每孔细胞的总蛋白量。ALP活性以总蛋白量标准化下的值来表示。

1.2.6细胞内胶原蛋白检测诱导细胞成骨性

将BMSCs单层细胞接种于48孔细胞培养板的膜材料上，以细胞培养板为空白对照组，每组设6个复孔，细胞接种密度为1×104个/孔，第2 d细胞培养液换成含成骨细胞诱导剂的培养液，共培养7、14 d后，PBS冲洗3次，每孔加入200 μL的10% Triton-X100溶液裂解细胞，4 ℃条件下孵育12 h，将裂解液吸出，用羟脯氨酸试剂盒检测胶原含量。

1.2.7细胞免疫荧光染色检测诱导细胞成骨性

将BMSCs单层细胞接种于6孔细胞培养板的膜材料上，细胞接种密度为5×104个/孔，第2 d细胞培养液换成含成骨细胞诱导剂的培养液，共培养14 d后，PBS冲洗3次，每次5 min，用-20℃甲醛溶液在-20℃冰箱固定材料上的细胞8 min，0.2% Triton-X100打孔0.5 h后，加入Alexa fluor 594标记骨钙素(OCN)，罗丹明标记的鬼笔环肽染细胞骨架，再用DAPI复染细胞核，在激光共聚焦显微镜下观察细胞在材料上的黏附及染色情况。以细胞培养板为空白对照组，每组设3个复孔。

1.2.8茜素红染色检测细胞钙化情况

将BMSCs单层细胞接种于24孔细胞培养板的膜材料上，以细胞培养板为空白对照组，每组设3个复孔。细胞接种密度为2×104个/孔，培养第2 d细胞培养液换成含成骨细胞诱导剂的培养液，共培养14 d，PBS冲洗3次，每次5 min，用4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS冲洗3次，0.1%茜素红-TrisHCl室温下染30 min，PBS冲洗后光学显微镜下观察细胞染色情况。

1.2.9统计学分析

试验数据采用统计软件SPSS10.0进行分析，结果以均数±标准差(Mean±S.D.)表示，对所得数据进行单因素的方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 扫描电子显微镜观察

从静电纺胶原纳米纤维膜及各组胶原/壳聚糖复合纳米纤维膜的扫描电镜图(见图1)可见，COL组混合液电纺可得到表面光滑、连续均匀的纳米纤维，经测量直径为66±10 nm。胶原、壳聚糖、PEO三者质量比为5∶1∶4时，电纺可得到表面较光滑、连续均匀的纳米纤维膜COL/CHI-1，经测量纤维直径为78±16 nm。三者质量比是5∶2∶3时，可见COL/CHI-2膜中纳米纤维丝，但同时可见有串珠状结构。当质量比为5∶4∶1时，可见COL/CHI-3膜表面有大量的串珠，珠子体积变大，纳米纤维状结构减少。

图1 各组静电纺丝纳米纤维膜交联前后扫描电镜图。 (a) 交联前胶原纳米纤维膜；(b) 交联前胶原/壳聚糖纳米纤维膜-1；(c) 交联前胶原/壳聚糖纳米纤维膜-2；(d) 交联前胶原/壳聚糖纳米纤维膜-3； (e) 交联后胶原纳米纤维膜；(f) 交联后胶原/壳聚糖纳米纤维膜-1Fig.1 Scanning electron microscopy micrographs of collagen and collagen/chitosan nanofibrous membranes before and after crosslinking. (a)Collagen nanofibrous membrane before crosslinking; (b)Collagen/chitosan nanofibrous membrane-1 before crosslinking; (c)Collagen/chitosan nanofibrous membrane-2 before crosslinking; (d) Collagen/chitosan nanofibrous membrane-3 before crosslinking；(e)Collagen nanofibrous membrane after crosslinking;(f) Collagen/chitosan nanofibrous membrane-1 after crosslinking

COL纳米纤维及COL/CHI-1复合纳米纤维经戊二醛蒸汽交联后扫描电镜观察发现，二者纳米纤维膜的纤维直径均有所增大。而COL/CHI-2和COL/CHI-3复合纳米纤维膜在交联过程中膜结构破解，未观察到两组纳米膜交联后扫描电镜图。因此将COL/CHI-1组选为了实验组，命名为胶原/壳聚糖复合纳米纤维膜(COL/CHI)。

2.2 MTT法检测细胞黏附与增殖

本实验采用MTT法检测骨髓间充质干细胞在不同材料表面的增殖能力。在细胞接种薄膜后1、4和7 d后，细胞在3种不同材料表面均呈持续性增加(见图2)。在培养7 d后，COL/CHI组OD值高于TCP组及COL组并具有统计学差异(P<0.05)，提示与TCP组及COL组相比，COL/CHI组更有利于细胞生长及增殖且无细胞毒性。

图2 纳米纤维膜表面骨髓间充质干细胞增殖情况(*：P<0.05)Fig.2 Viability of BMSCs on the nanofibrous membranes(*：P<0.05)

2.3 碱性磷酸酶(ALP)检测诱导细胞成骨性

本实验采用碱性磷酸酶试剂盒检测纳米纤维膜对骨髓间充质干细胞的诱导分化合成碱性磷酸酶的能力，结果显示：随着时间延长，3组中细胞ALP的含量均逐渐增高，细胞分别培养7和14 d后，COL/CHI组和COL组的ALP活性均高于空白对照TCP组，并具有统计学差异(P<0.05)，而COL/CHI组虽高于COL组，但不具有统计学差异(P>0.05；见图3)。

图3 纳米纤维膜表面骨髓间充质干细胞ALP活性情况(*：P<0.05)Fig.3 The ALP activity of BMSCs on the nanofibrous membranes(*：P<0.05)

2.4 细胞内胶原检测诱导细胞成骨性

本实验采用羟脯氨酸试剂盒检测纳米纤维膜对骨髓间充质干细胞的诱导分化合成胶原的能力，结果显示：随着时间延长，3组中细胞胶原的含量均有所增高。细胞培养7 d后，COL/CHI组和COL组的胶原含量较TCP组高，并且COL/CHI组对于TCP组有统计学差异(P<0.05)，在14 d时，COL/CHI组胶原含量均高于COL组和TCP组，且对于两组均具有统计学差异(P<0.05)(见图4)。

图4 纳米纤维膜表面骨髓间充质干细胞内胶原含量情况(*：P<0.05)Fig.4 The collagen content of BMSCs on the nanofibrous membranes(*：P<0.05)

2.5 细胞免疫荧光染色检测诱导细胞成骨性

图5显示了在细胞培养14 d后免疫染色后荧光显微镜下的细胞形态图，细胞核被染为蓝色，细胞骨架被染成绿色，从细胞骨架染色可见空白对照组细胞形态为梭形，而COL/CHI组和COL组细胞伸出树突状结构，并且细胞之间通过细胞突起相互连接。细胞内骨钙素(OCN)被染成红色，图中显示COL/CHI组较COL组和TCP组染色均深。

2.6 茜素红染色检测细胞钙化程度

图6显示了细胞在培养14 d后茜素红染色情况，可见TCP组基本无矿化结节染色，而COL组和COL/CHI组矿化结节染色较多，且COL/CHI组的矿化结节染色面积最大。

图5 纳米纤维膜表面骨髓间充质干细胞免疫荧光染色。(a)：TCP组；(b)：COL组；(c)：COL/CHI组Fig.5 Immunofluorescent staining of osteocalcin after BMSCs cultured on the nanofibrous membranes for 14 days. (a) Tissue culture plate; (b) Collagen nanofibrous membrane; (c) Collagen/chitosan nanofibrous membrane

图6 纳米纤维膜表面骨髓间充质干细胞茜素红染色。(a)：TCP组；(b)：COL组；(c)：COL/CHI组Fig.6 Alizarin red staining of BMSCs cultured on the nanofibrous membranes for 14 days. (a)Tissue culture plate; (b)Collagen nanofibrous membrane; (c)Collagen/chitosan nanofibrous membrane

3 讨论

骨组织工程中生物支架需满足能够模拟天然细胞外基质的成分、结构特征及机械性能的要求[2, 13-14]。静电纺丝技术制备的三维纳米纤维支架可模拟天然细胞外基质的结构，具有高表面积体积比、高机械强度及良好的生物学活性，因而在骨组织工程生物支架的研究中广受关注[15-17]。

胶原是组成细胞外基质的主要成分，壳聚糖是自然界第二丰富的天然生物聚合物，具有与天然细胞外基质中糖胺聚糖类似的结构，两者混合可模拟天然细胞外基质的主要有机成分[18-19]。本实验中胶原、壳聚糖、PEO三者质量比是5∶1∶4时，静电纺薄膜的纳米纤维表面光滑，无串珠样结构。说明三者以合适的比例混合时，PEO能够打开胶原和壳聚糖分子内的较强作用力，为两者提供了相互缠绕拉伸的轴，从而制备了均一的纳米纤维。研究发现，混有PEO的电纺薄膜经过交联及漂洗处理后经红外检测不含或只有痕量PEO，这意味着PEO只是作为静电纺丝的增塑剂，具有可去除的优点[10]。

骨组织工程中生物支架的表面形态、结构及孔隙等可影响基质细胞的生物学反应，从而影响基质细胞的黏附、生长、增殖和分化[15]。多数研究表明，静电纺丝纳米纤维有利于各种干细胞的生长增殖和分化，如间充质干细胞、成骨细胞、神经干细胞及胚胎干细胞等[15, 20]。Zhang等研究发现，纳米纤维表面的胶原支架与多孔表面的胶原支架相比，前者可更好地促进骨髓间充质干细胞细胞的增殖和分化[15]。Dalby等研究发现，无序的三维纳米纤维具有与地塞米松相类似的诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的效应[21]。Oh等在未采用骨诱导剂的二氧化钛纳米管上培养人类间充质干细胞以研究其分化潜能，结果发现，在直径小于30 nm的纳米管更有利于促进细胞的黏附增殖，而直径在70～100 nm的大尺寸纳米管则更有利于促进细胞分化为成骨样细胞[22]。

关于纳米纤维支架诱导骨髓间充质干细胞分化的机制，Liu等研究发现，羟基磷灰石/壳聚糖纳米纤维支架可激活骨髓间充质干细胞的整合素-骨形态形成蛋白(BMP)/Smad信号通路诱导其分化[23]。 Xue等学者研究发现，PCL纳米纤维支架通过激活Wnt / β-catenin 和Smad3信号通路诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，定量PCR检测到基质细胞表达ALP、骨形态形成蛋白-2(BMP-2)及胶原等的mRNA量显著增加[20]。Lu等研究发现，聚β-羟基丁酸戊酸酯/纳米羟基磷灰石(PHBV/nHA)纳米纤维支架可诱导骨髓间充质干细胞表达或产生ALP、 OCN及矿化结节等成骨细胞分化成熟的标记物，将PHBV/nHA纳米纤维支架植入新西兰大白兔颅骨直径为1.5 cm的骨缺损处，12周后发现，纳米纤维支架组颅骨缺损处基本被新生骨覆盖，而对照组的颅骨缺损处新生骨较少[24]。Shin等将壳聚糖纳米纤维支架应用于新西兰大白兔颅骨直径为10 mm圆形骨缺损处，4周后发现原骨缺损已完全愈合。因此可见，壳聚糖纳米纤维支架有利于促进骨缺损的修复再生[17]。

本研究中免疫荧光染色实验显示骨髓间充质干细胞在两组纳米纤维膜上伸出树突状的结构铺展黏附于纳米纤维表面，具有良好的细胞生长形态。MTT实验表明，COL组和COL/CHI组均可促进细胞的生长增殖，且COL/CHI组促进细胞增殖作用最好，说明壳聚糖与胶原的混合后可性能互补，分子间相互作用产生的聚合物更有利于细胞的生长，与王培伟等[25]的研究相一致。细胞分化实验结果表明，COL组和COL/CHI组纳米纤维膜上培养骨髓间充质干细胞可诱导其分化成熟并表达ALP、胶原、骨钙素及生成矿化结节，且在细胞培养14 d时，COL/CHI组对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用优于COL组。

本实验对两组纳米纤维膜的降解未做研究，Chen等研究发现，胶原/壳聚糖纳米纤维膜在体内完全降解的时间在9～15周之间[10]。本实验中观察到两组纳米纤维膜在细胞培养板培养两周后，膜状结构未见分解，而关于其体内降解时间还有待进一步研究。且后续实验还需对胶原/壳聚糖纳米纤维支架在动物体内是否能引导骨缺损修复再生做出进一步的研究。

4 结论

由此可见，胶原纳米纤维膜和胶原/壳聚糖纳米纤维膜均有利于骨髓间充质干细胞的黏附、生长及增殖，且能促进其分化，而胶原/壳聚糖纳米纤维膜促进骨髓基质干细胞增殖和诱导细胞成骨性更强，有望应用于骨组织工程领域。

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