结合磁共振成像和脑机接口的新型在体生物电子鼻的研究

张 斌 吴 哲 何宏建 丁秋萍 秦 臻 高克强 钟健晖 王 平#

(浙江大学生物医学工程与仪器科学学院生物传感器国家专业实验室, 生物医学工程教育部重点实验室, 脑影像科学技术中心， 杭州 310007)

引言

气体检测在食品安全、缉毒搜爆、环境监测等领域具有重要的意义[1]。哺乳动物的嗅觉系统在寻找食物或配偶，躲避天敌等方面具有重要作用，其具有高灵敏度和高特异性，是一种十分适合气味检测和识别的气体传感器。哺乳动物嗅觉系统包括嗅上皮、嗅球和嗅皮层。气体分子与嗅上皮中的嗅感觉神经元(olfactory sensory neurons, OSNs)上的受体结合，产生动作电位[2]，并沿嗅感觉神经元的轴突传导到嗅球中嗅小球中的僧帽/丛状(M/T)细胞[3]。嗅觉信息在嗅球中被整合和编码[4]，并最终在嗅皮层中形成嗅感觉。人工电子鼻模仿这一机制，并在过去的几十年中应用于许多领域[5-8]。然而，电子鼻的性能与动物嗅觉系统相比相去甚远，因而出现了基于脑机接口和神经解码技术的在体生物电子鼻。该方法通过在嗅球中植入电极并记录电生理信号，可以得到比电子鼻更多的气味信息[9-11]。

尽管在体生物电子鼻能得到更多的气味信息，但目前电极的植入位置主要依靠脑图谱定位和实验经验，其成功率不高，很难直接找到对某一指定气体敏感的神经元或区域。目前国内外已有嗅觉图谱方面的研究，主要采用2-脱氧葡萄糖(2DG)摄取量制图[12-13]和功能磁共振成像(fMRI如血氧水平依赖(BOLD)成像技术)[14-15]。2DG法需要对嗅球进行切片、X光成像等处理，过程复杂、工作量大，同一只动物无法进行多次实验[12-13]；BOLD成像克服了以上缺点，但其检测的是激活脑区及其周围区域血液动力学变化，只能间接反映神经元活动，且功能磁共振激活区域与真实的活动区域是否完全一致在学术界尚有争论。相比上述两种方法，锰离子增强磁共振成像技术(MEMRI)是一种更合适的技术[16]。

磁共振成像(MRI)是一种无创的成像技术，且无CT和X光等成像技术中存在的有害辐射，不会对检测对象造成伤害[17]。因此，MRI目前广泛应用于临床诊断和基础研究，尤其是在脑功能成像方面，是一种极其重要的工具[18]。锰离子增强磁共振通过在生物体内引入外源性的锰离子(Mn2+)作为磁共振对比剂来在体、直接、动态等研究脑区的功能活动[19]。MEMRI的实现基于Mn2+的两个特点：Mn2+是一种钙离子(Ca2+)类似物，在嗅觉神经系统中，当嗅感觉神经元与气体分子结合，钙离子通道打开，Mn2+会像Ca2+一样通过Ca2+通道进入嗅觉系统，并在经过的神经细胞中沉积，需要数天甚至更久才会被完全代谢[20]；Mn2+是一种顺磁性很强的物质，会缩短其周围水质子的T1和T2弛豫时间[21]。

本研究基于脑机接口和锰离子增强磁共振成像技术提出了一种新的气体检测方法，通过在大鼠单侧鼻腔内滴入MnCl2溶液并给予气味刺激，扫描磁共振图像，并根据图像确定嗅球中气体特异性区域，在该区域植入微丝阵列电极，记录和分析嗅觉电生理信号进行气味识别。该方法对正丁酸和乙酸异戊酯具有很低的检测下限。

1 材料和方法

1.1 动物准备与气体刺激

正丁酸、辛醇、乙酸异戊酯分别具有典型的官能团，有特殊的气味并且其气味有一定的差异，是嗅觉研究中较为常用的物质。因此在本研究中选取了这三种物质作为刺激气体。气体由无色无味的矿物油进行稀释，浓度为10-1～10-9mol/L，并储存在密封玻璃瓶中。

本实验选取健康的雄性SD大鼠(200～250 g)，从腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后，用移液枪在大鼠右侧鼻腔滴入20 μL MnCl2溶液(400 mmol/L)，为使MnCl2溶液分布较均匀，溶液分4次滴入右侧鼻腔的不同深度，且始终保持大鼠处于仰卧位以保持溶液与嗅上皮接触[22]。将大鼠放在一个密封的长方形有机玻璃箱中央，在靠近大鼠鼻子处和笼子4个角落均放置一个小玻璃皿，每个玻璃皿中滴有0.1 mL刺激气体溶液(0.1 mol/L)，大鼠在箱子中始终保持仰卧位。10 min后大鼠被固定在磁共振兼容的大鼠适配器上并放入核磁共振仪中进行MRI扫描。

1.2 MEMRI数据采集

MEMRI数据采集在西门子MAGNETOM Prisma 3T磁共振上进行，采用4 cm单通道环形线圈紧贴大鼠鼻腔外侧上方的方式进行扫描。使用3D FISP序列，其具体参数如下：TR 20 ms，TE 5.2 ms，图像大小256像素×153像素×22像素，空间分辨率0.195 mm×0.195 mm×0.5 mm，激发角30°。考虑到体素体积较小，因此采用扫描10次平均的方式以增加信噪比，每次扫描时间为11 min 10 s。

本实验共对10只大鼠(4只使用乙酸异戊酯、4只使用正丁酸、2只使用辛醇)进行了气味刺激下的MEMRI扫描，其中辛醇刺激的一只大鼠在扫描期间死亡。每只大鼠在滴入氯化锰溶液之前，以及滴入氯化锰溶液之后的0.5、2.5和 6 h分别进行了扫描。扫描分别在大鼠的横断位与冠状面进行。扫描过程中对大鼠一直进行气味刺激。

1.3 嗅觉电生理信号采集

为了同步记录多个嗅球区域的神经元信号，本研究设计制作了16通道微丝阵列电极。将16根直径35 μm的镍铬合金丝(AM system，WA，#762000)两两旋成一股，并整齐排列在PCB板两面。双股电极丝的间距为100～200 μm。电极上留有转接口可与神经信号采集系统相连。本研究采用Plexon公司的OmniPlex神经信号采集系统记录嗅觉电生理信号，该系统将信号放大滤波后存储在计算机中，其采样频率为40 kHz，放大倍数为1 000倍，滤波范围为0.5 Hz～8 kHz。

大鼠从磁共振扫描中恢复后，从腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)再次麻醉，并固定在立体定位仪上。手术在无菌条件下进行，利用开颅手术移除嗅球上方的头骨，暴露出嗅球背部，用液压微推进器将电极缓慢植入到嗅球僧帽细胞层，具体位置由MEMRI实验结果确定。用牙科水泥将电极进行包埋固定。

大鼠休养一周后进行气体检测实验。从腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后至于行为箱(长30 cm，宽25 cm，高30 cm)中，头部电极与OmniPlex系统前置探头相连，将滴有0.1 mL气体溶液的滤纸放于大鼠鼻腔旁，停留5 s，记录气体刺激前5 s和刺激后10 s内的电生理信号。在开始下一次气体刺激前向行为箱中通入新鲜空气并等待2 min以上。

1.4 数据处理

磁共振扫描图像主要由RadiAnt DICOM Viewer和MRIcroN查看，并借助MATLAB和NIfTI工具包进行数据分析。

电生理数据由Matlab进行离线处理，利用巴特沃斯数字带通滤波器分别提取出spike信号(200～400 Hz)和局部场电位(local field potential，LFP)信号(1～100 Hz)。采用双阈值法可以提取单个神经元的spike锋电位，计算各个时间窗内的发放频率，并计算气味刺激前后的spike发放频率差值。LFP是局部场电位，是记录位点周围神经元电信号的综合响应，本研究对LFP进行了频谱分析。

2 结果

2.1 Mn2+在嗅觉系统中的传递

图1中给出了大鼠右侧鼻腔中滴入Mn2+并给予乙酸异戊酯气味刺激后的部分磁共振扫描结果，图中从上至下分别为嗅上皮所在的其中一个层面的冠状位MRI图像，嗅球所在的其中一个层面的冠状位MRI图像，以及嗅球所在的其中一个层面的横断位MRI图像，从左至右分别为尚未滴入锰离子溶液与滴入后0.5、2.5和6 h后的MRI图像。如图1所示，滴了Mn2+的右侧鼻腔中，锰离子逐渐进入嗅觉系统，并明显增强了磁共振信号。在实验刚开始时，Mn2+尚未进入嗅觉系统，嗅上皮和嗅球左右两部分无明显区别；滴入Mn2+0.5 h后，大鼠右侧嗅上皮中部分区域信号相比左侧明显更强(图像更亮意味着信号更强)，但嗅球中并未看到明显变化。2.5 h后，右侧的嗅上皮和嗅球均有部分区域比右侧更亮，即Mn2+已经进入了嗅球并且在嗅上皮中仍有残留。6 h后，右侧的嗅上皮仍比左侧更亮，而嗅球中变亮的区域相比2.5 h时的区域明显变大(无论是横断位还是冠状位图像)，说明Mn2+在不断地进入嗅球的其他区域。

为了解Mn2+在嗅球中特定部位的浓度变化，笔者测量了在乙酸异戊酯刺激实验中4只大鼠同一位置(图1红色黑色所指的黑色圆点处)的MRI信号强度，并以对侧嗅球对称位置的信号强度作为基准值得到相比强度，以尽量消除大鼠个体差异性等造成的干扰。如图2所示，无论是该点的信号绝对强度还是相对强度，均呈明显的上升趋势，说明该点的Mn2+浓度在不断增长。

2.2 不同气味诱发嗅球不同区域响应

当大鼠受到不同的气体刺激时，由于对气体分子有响应的嗅感觉神经元不同，因此Mn2+会进入不同的嗅感觉神经元，并最终进入嗅球的不同区域。图3 给出了4只大鼠在气味刺激4 h后嗅球同一层的MRI图像，其中大鼠A和B的刺激气体为正丁酸，大鼠C刺激气体为辛醇，大鼠D的刺激气体为乙酸异戊酯。

如图3所示，被3种不同气体刺激的大鼠的嗅球发亮区域有明显区别，而两只被正丁酸刺激的大鼠的嗅球发亮区域较相似：对正丁酸有响应的区域集中在嗅球的腹外侧边缘，对辛醇有响应的区域集中在嗅球腹侧，对乙酸异戊酯有响应的区域集中在嗅球的外侧。

图1 大鼠右侧鼻腔注射Mn2+并用乙酸异戊酯刺激后大鼠嗅觉系统MRI图像随时间的变化(每行从左至右分别为0、0.5、 2.5、 6 h)。(a)嗅上皮(冠状位)；(b)嗅球(冠状位)，黑色箭头所指的黑点为图2中采集数据的位置；(c)嗅球(横断位)Fig.1 The MRIs of rat′s olfactory system changed over time after Mn2+ administration and isoamyl acetate stimulation (From the left to the right in each row, the time evolution is 0, 0.5, 2.5 and 6 h after Mn2+ administration). (a) Olfactory epithelium (coronal); (b) Olfactory bulb (coronal). The black dots pointed by the arrows represent where data in Fig.2 are collected; (c) Olfactory bulb (transverse)

图2 乙酸异戊酯刺激下嗅球某一位置MRI信号强度随时间的变化。(a)绝对信号强度；(b)相对信号强度Fig.2 MRI signals at the same position of rats’ OBs along time after isoamyl acetate stimulation. (a)Absolute signal amplitude; (b) Relative signal amplitude

图3 不同气味刺激使Mn2+在大鼠嗅球的不同区域累积(图像中越亮的区域说明Mn2+更多)。(a)大鼠A(正丁酸)；(b)大鼠B(正丁酸)；(c)大鼠C(辛醇)；(d)大鼠D(乙酸异戊酯)Fig.3 Mn2+ accumulation regions varied when rats were stimulated by different odors (Brighter represents more Mn2+ accumulation). (a) Rat A (n-butyric acid); (b) Rat B (n-butyric acid); (c) Rat C (octanol); (d) Rat D (isoamyl acetate)

2.3 电生理信号对气味刺激的响应

图5 Spike信号分析(虚线为气体刺激起始时刻)。(a)嗅球外侧单个通道在乙酸异戊酯刺激前后的spike信号；(b)该段信号对应的不同时间窗内的发放频率；(c)该段信号所有spike信号的叠加Fig.5 Analysis of spike signal (The dotted line represents the start of odor stimulation). (a)Spike signal recorded by one channel in the lateral OB before and after isoamyl acetate stimulation; (b)Spike firing frequency in different time bins; (c)All spike waveforms overlapping.

根据MEMRI的实验结果可知，不同气味在嗅球中引起响应的区域不同，因此在大鼠嗅球不同的位置(嗅球腹外侧：Bregma点前8.5 mm，骨缝线右侧1.5 mm，深度2.0 mm；嗅球外侧：Bregma点前8.5 mm，骨缝线右侧1.0 mm，深度4.0 mm)分别植入电极并记录电生理信号。如图4所示，嗅球腹外侧的LFP信号在受到正丁酸气味刺激后会发生变化(见图4(a))，β波(15～30 Hz)在气味刺激后幅值增大(见图4(b))，对比气味刺激前后的频谱图发现，在15～40 Hz频段信号明显增强(见图4(c))。但用乙酸异戊酯气味刺激该区域的LFP并没有明显变化(见图4(d)～(f))。

嗅球外侧的LFP信号在受到乙酸异戊酯气味刺激后也会发生变化(见图4(g))，β波(15～30 Hz)在气味刺激后幅值增大(见图4(h))，对比气味刺激前后的频谱图发现，在15～30 Hz频段信号明显增强，但用正丁酸气味刺激该区域的LFP并没有明显变化(图中未给出)。

每个植入到大鼠嗅球中的电极有16个通道，其中通常能在几个通道的信号中检测到较为稳定和高信噪比的spike锋电位。当大鼠受到气味刺激时，某些通道的spike信号也会发生变化，其发放频率会增加或减少。图5(a)给出了嗅球外侧一个通道在乙酸异戊酯刺激实验中记录的信号。图5(b)为该段信号不同时间窗内的发放频率，在给予气味刺激后，发放频率明显升高。图5(c)为该段时间内所有spike锋电位的叠加。图6给出了植入在嗅球外侧的电极在乙酸异戊酯刺激实验中记录到spike的6个通道在乙酸异戊酯刺激前后平均发放频率的变化，可以看出某些通道的发放频率增加了，某些通道的发放频率降低了，而某些通道没有明显变化。某些通道在气体刺激后不仅会改变发放频率，而且其频率变化与刺激气体的浓度呈现较好的线性(见图7)。根据最低检测限的定义，这两个通道对乙酸异戊酯和正丁酸的检测下限分别为0.033 0 和0.007 2 μmol/mL。

图4 嗅球LFP信号分析(左侧图中的虚线为气体刺激开始时刻)。(a)～(c)正丁酸刺激前后嗅球腹外侧LFP信号、β波信号和刺激前后的LFP频谱图；(d)～(f)乙酸异戊酯刺激前后嗅球腹外侧LFP信号、β波信号和刺激前后的LFP频谱图；(g)～(i)乙酸异戊酯刺激前后嗅球外侧LFP信号、β波信号和刺激前后的LFP频谱图Fig.4 Analysis of LFP signals in OBs (In the left plots, the dotted line represents the start of odor stimulations). (a)～(c)LFP and β wave in the ventral lateral OB and the spectrogram of LFP before and after n-butyric acid stimulation; (d)～(f)LFP and β wave in the ventral lateral OB and the spectrogram of LFP before and after isoamyl acetate stimulation; (g)～(i)LFP and β wave in the lateral OB and the spectrogram of LFP before and after isoamyl acetate stimulation.

图6 植入在嗅球外侧的电极中的6个通道在乙酸异戊酯刺激实验中的频率变化Fig.6 The 6 channels of the electrode implanted in the lateral OB had different firing frequency variations in the isoamyl acetate stimulation trail

图7 频率响应-浓度曲线。(a)乙酸异戊酯；(b)正丁酸Fig.7 The responsive firing rate curve to different concentrations of odors. (a)Isoamyl acetate; (b)N-butyric acid

3 讨论

研究发现，Mn2+在嗅上皮和嗅球中的传递速度有较大区别。在大鼠鼻腔滴入Mn2+并进行气味激10 min后，立即扫描MRI图像即可在嗅上皮中观察到Mn2+的存在，大约1 h后可以在嗅球前侧观察到Mn2+的沉积。而Mn2+在嗅球中的传递速度要慢得多，如图1中嗅球冠状位和横断位MRI图像所示，Mn2+从2.5～6.0 h之间传递的距离很小。这与文献中的结果类似[15]。人们猜测，出现这一现象的原因可能是嗅球中的结构相比嗅上皮到嗅球的神经投射更复杂，嗅球中的突触更多，神经元之间的连接更复杂，而Mn2+在突触的传播速度可能会受到限制，因而影响了其在嗅球内的传播速度。

本研究利用MEMRI显示了嗅觉通路的一部分，Mn2+的沉积路径可视为嗅觉信号的传导路径。从MRI图像可以看出，单种气味分子会激活嗅上皮上的大片嗅感觉神经元，并投射到嗅球中的某个区域，而不是只与一种神经元结合并投射到单个嗅小球。实际上，嗅感觉神经元与气味分子之间存在交叉响应，即一种气味分子可以激活多种神经元，而一种神经元会对多种气体分子产生响应[3,11]。嗅上皮中同一种嗅感觉神经元会投射到同一个嗅小球中。因此，单种气味分子也会激活多个嗅小球，即在MRI图像中嗅球会有某一片区域发亮(见图1)；同一个嗅小球会被多种气体激活，即MRI图像中嗅球发亮区域会有重叠(见图3)。

本研究在人体3T磁共振扫描仪上扫描大鼠，对于序列可实现的空间分辨率和信噪比具有较高要求。基于两方面因素的综合考虑，并未采用锰离子增强MRI常用的T1W SE或IR-SE序列，而是选用了3D FISP序列。该序列产生的是T1/T2加权图像，即具有较小T1/T2比值的组织将产生更大信号。

在MEMRI实验中对某种有响应的区域的LFP对响应的气体也会有响应，该气体刺激会使LFP信号中的β波能量增强，而其他气体的刺激并无此现象(见图4)，证明电生理方法与MEMRI测得的响应区域相同(见图5)。Spike信号对气味刺激也会有响应，且不同的通道对同一种气味的响应不同(见图6)。利用某些通道spike发放频率变化对特定气体的浓度的响应，可以检测到浓度较低的气体分子(见图7)，且检测限比传统电子鼻更低[23]，能较好发挥哺乳动物嗅觉高灵敏度的优势。

本研究同时存在一定的局限性，如MRI图像的分辨率(195 μm)大于嗅小球的尺寸(50～100 μm)，而嗅小球是嗅球中的功能单元，因此本研究尚不能发现刺激气味与嗅小球之间的响应关系，本课题组正在尝试使用更高磁场强度的磁共振仪器，得到分辨率和图像质量都更高MRI图像。

4 结论

本研究利用锰离子增强磁共振成像技术研究了嗅觉信息的传导通路，证明了嗅觉的交叉响应机理。通过磁共振图像标记了嗅球中的对特定气体敏感的区域，辅助电生理定位，在相应的嗅球区域植入微丝阵列电极。实验结果表明，嗅觉信号中的LFP和spike信号都对气体产生响应。据此，设计了新型的高特异性、低检测下限的气体检测系统。本研究是第一个利用磁共振辅助定位的生物电子鼻，在爆炸物搜索、食品安全等方面将有广阔的前景。

[1] Lledo PM, Gheusi G, Vincent JD. Information processing in the mammalian olfactory system[J]. Physiological Reviews, 2005, 85(1): 281-317.

[2] Malnic B, Hirono J, Sato T, et al. Combinatorial receptor codes for odors[J]. Cell, 1999, 96(5): 713-723.

[3] Guo Tiantian, Zhuang Liujing, Qin Zhen, et al. Multi-odor discrimination by a novel bio-hybrid sensing preserving rat's intact smell perception in vivo[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2016, 225: 34-41.

[4] Davison IG, Katz LC. Sparse and selective odor coding by mitral/tufted neurons in the main olfactory bulb[J]. The Journal of Neuroscience, 2007, 27(8): 2091-2101.

[5] Broza YY, Haick H. Nanomaterial-based sensors for detection of disease by volatile organic compounds[J]. Nanomedicine, 2013, 8(5): 785-806.

[6] Röck F, Barsan N, Weimar U. Electronic nose: Current status and future trends[J]. Chemical Reviews, 2008, 108(2): 705-725.

[7] Haick H, Broza YY, Mochalski P, et al. Assessment, origin, and implementation of breath volatile cancer markers[J]. Chemical Society Reviews, 2014, 43(5): 1423-1449.

[8] Konvalina G, Haick H. Sensors for breath testing: From nanomaterials to comprehensive disease detection[J]. Accounts of Chemical Research, 2013, 47(1): 66-76.

[9] Zhuang Liujing, Hu Ning, Dong Qi, et al. A high sensitive in vivo biosensing detection for odors by multiunit in rat olfactory bulb[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2013, 186: 308-314.

[10] Zhuang Liujing, Hu Ning, Tian Feng, et al. A high-sensitive detection method for carvone odor by implanted electrodes in rat olfactory bulb[J]. Chinese Science Bulletin, 2014, 59(1): 29-37.

[11] Zhuang Liujing, Guo Tiantian, Cao Dduanxi, et al. Detection and classification of natural odors with an in vivo bioelectronic nose[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2015, 67: 694-699.

[12] Duveau A, Astic L. Spatial distribution of [14 C] 2-deoxyglucose uptake in the olfactory bulbs of rats stimulated with two different odours[J]. Brain Research, 1980, 188(1): 139-154.

[13] Mamlouk AM. Learning olfactory codes using matrix factorization on 2DG uptake patterns from rats[J]. Flavour, 2014, 3(Suppl 1): 03.

[14] Li Bo, Gong Ling, Wu Ruiqi, et al. Complex relationship between BOLD-fMRI and electrophysiological signals in different olfactory bulb layers[J]. NeuroImage, 2014, 95: 29-38.

[15] Huttunen JK, Gröhn O, Penttonen M. Coupling between simultaneously recorded BOLD response and neuronal activity in the rat somatosensory cortex[J]. Neuroimage, 2008, 39(2): 775-785.

[16] Pautler RG, Silva AC, Koretsky AP. In vivo neuronal tract tracing using manganese-enhanced magnetic resonance imaging[J]. Magnetic Resonance in Medicine, 1998, 40(5): 740-748.

[17] Brand G, Millot JL, Henquell D. Complexity of olfactory lateralization processes revealed by functional imaging: A review[J]. Neuroscience & Biobehavioral Reviews, 2001, 25(2): 159-166.

[18] 方可. 锰离子增强磁共振成像 (MEMRI) 技术及其在研究大鼠嗅觉和脑缺血中的应用[D]. 北京：中国科学院研究生院, 2005.

[19] 杨艳梅, 姚振威, 冯晓源. 磁共振 DTI 技术和锰离子示踪方法活体定位鼠脑神经纤维[J]. 神经解剖学杂志, 2008, 24(4): 379-385.

[20] Pautler RG, Koretsky AP. Tracing odor-induced activation in the olfactory bulbs of mice using manganese-enhanced magnetic resonance imaging[J]. Neuroimage, 2002, 16(2): 441-448.

[21] Geraldes C, Sherry AD, Brown RD, et al. Magnetic field dependence of solvent proton relaxation rates induced by Gd3+ and Mn2+ complexes of various polyaza macrocyclic ligands: implications for NMR imaging[J]. Magnetic Resonance in Medicine, 1986, 3(2): 242-250.

[22] Massaad CA, Pautler RG. Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI)[J]. Magnetic Resonance Neuroimaging: Methods and Protocols, 2011: 145-174.

[23] Loutfi A, Coradeschi S, Mani GK, et al. Electronic noses for food quality: A review[J]. Journal of Food Engineering, 2015, 144: 103-111.