保护素DX对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用

卜克，王璐，刘林刚

（郑州大学第五附属医院，河南 郑州 450052）

脓毒症作为常见的危重症，是由各种因素导致的的全身炎性反应综合征，可导致全身各系统、多器官损伤，是危重病房患者主要致死因素[1]。其中，肺往往是最易受损器官，早期便可导致急性肺损伤，且病情进展迅猛，尚无特效的治疗方法，病死率较高[2]。因此，如何有效防治脓毒症所致急性肺损伤，已成为临床研究重点。研究发现[3]，过度炎症反应在脓毒症所致急性肺损伤发生、进展中发挥关键性作用。保护素DX（protectin DX，PDX）作为一种ω-3多不饱和脂肪酸代谢产物，近年来研究发现，可减少中性粒细胞中活性氧生成，具有较好的抗炎作用[4]。本研究通过复制小鼠脓毒症所致急性肺损伤模型，观察PDX对肺损伤保护作用，并探讨可能的机制，以期为脓毒症所致急性肺损伤临床防治提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂PDX（购自美国Cayman Chemical公司），HE染色试剂盒（购自北京中杉金桥生物公司），白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）检测试剂盒（购自碧云天生物工程公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（购自南京建成生物工程研究所），兔抗小鼠核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）多克隆抗体（购自美国SAB公司），兔抗小鼠核因子κB抑制蛋白α抗 原（nuclear factor kappa B inhibitor alpha antigen，IκB-α）多克隆抗体（购自美国Santa Cruz公司）。

1.1.2 实验动物及分组清洁级健康雄性昆明小鼠45只购自河南省实验动物中心[合格证号：SCXX（豫）2010-0002]，6～8周龄，体重18～23 g，饲养于标准条件下，自由进食、饮水，利用随机数字表随机分为假手术组、脓毒症组和PDX干预组，每组15只。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脓毒症模型复制按照文献[5]中的方法复制小鼠脓毒症模型：用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取仰卧位，消毒后，取腹正中线切口，将肠系膜和盲肠末端游离，用4号无菌丝线在回盲瓣以下进行结扎，用针头于盲端部位进行穿孔，挤出少量粪便后，还纳腹腔，逐层关闭腹腔，苏醒后自由进食、饮水。假手术组小鼠仅开腹而不结扎盲肠及穿孔。术毕60 min后，PDX干预组小鼠腹腔注射1 μg的PDX[6]，假手术组和脓毒症组则给予等量的生理盐水。实验过程中脓毒症组3只小鼠死亡，PDX干预组2只小鼠死亡。

1.2.2 各组小鼠肺组织病理学观察建模24 h后，各组小鼠处死后，开胸留取右肺组织，4%甲醛固定，石蜡包埋、切片后，行HE染色，光学显微镜下观察肺组织病理学变化，并进行肺损伤评分[7]：根据肺间质水肿、炎症细胞浸润、肺泡水肿、肺泡出血、肺不张、透明膜形成病变程度，按照正常、轻度、中度、重度分别按0～3分计分。

1.2.3 各组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、MDA水平检测取各组小鼠左下肺组织，研磨后制备肺组织匀浆，4℃下3 500 r/min离心15 min，留取上清，保存于-20℃冰箱。利用ELISA检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平，所有操作均在标准实验室完成。

1.2.4 Western blot检测肺组织胞核中NF-κB和胞浆中IκB-α蛋白表达取各组小鼠右下肺组织约80 mg，预冷PBS洗涤3次，将核蛋白提取裂解缓冲液加入，置于冰上静置20 min，匀浆后，将细胞裂解液NP-40加入，于4℃下于12 000 r/min离心40 s，取上清作为胞浆蛋白。沉淀物则用预冷PBS冲洗2次，4℃下于12 000 r/min离心40 s，将核蛋白提取裂解液加入，置于冰上静置25 min，于4℃下于12 000 r/min离心120 s，取上清作为核蛋白，置于-70℃冰箱冷冻保存备检。用Bradford法检测蛋白浓度。取30 μg总蛋白，用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，4℃条件下用湿式转膜法转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温下封闭60 min，TBST液漂洗30 min，分别将一抗兔抗小鼠NF-κB、IκB-α多克隆抗体（稀释比例1∶1 000、1∶1 200）加入，室温下静置60 min，TBST漂洗30 min，加入二抗，TBST漂洗30 min，加入ECL反应液显影，拍照后，用Image J图像分析软件分析条带获得胞核中NF-κB和胞浆中IκB-α蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，行方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肺组织病理学变化

假手术组小鼠肺组织形态正常，肺泡腔清晰可见，间隔无水肿及炎症细胞浸润；脓毒症组小鼠肺组织间隔增加，间质水肿，有大量炎症细胞聚集，出现肺泡腔融合，腔内出现有点状或片状出血；PDX干预组小鼠肺组织病变较脓毒症组减轻，见图1。

2.2 各组小鼠肺组织损伤严重程度组织学评分

假手术组、脓毒症组和PDX干预组小鼠肺组织损伤组织学评分分别为（2.4±1.0）、（13.7±1.3）及（6.4±1.6）分，与假手术组比较，脓毒症组和PDX干预组小鼠肺组织损伤组织学评分均升高，与脓毒症组比较，PDX干预组小鼠肺组织损伤组织学评分则降低，差异有统计学意义（F=253.323，P=0.000）。

2.3 各组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平比较

假手术组、脓毒症组和PDX干预组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平差异有统计学意义（F=1980.915、141.627、62.851、44.720及78.345，均P=0.000），两两比较，与假手术组比较，脓毒症组和PDX干预组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与脓毒症组比较，PDX干预组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.4 各组小鼠肺组织胞核中NF-κB和胞浆中IκB-α蛋白表达比较

假手术组、脓毒症组和PDX干预组小鼠肺组织胞核中NF-κB和胞浆中IκB-α蛋白相对表达量比较差异有统计学意义（F=55.675和123.909，均P=0.000）；两两比较，与假手术组比较，脓毒症组和PDX干预组小鼠肺组织胞核中NF-κB蛋白相对表达量均升高，而胞浆中IκB-α蛋白相对表达量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与脓毒症组比较，PDX干预组小鼠肺组织胞核中NF-κB蛋白相对表达量均降低，而胞浆中IκB-α蛋白相对表达量均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2和图2。

图1 各组小鼠肺组织病理学变化 （HE×200）

表1 各组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平比较 （±s）

表1 各组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平比较 （±s）

注：1）与假手术组比较，P ＜0.05；2）与脓毒症组比较，P ＜0.05

组别 例数 IL-1β/（pg/mg） IL-6/（pg/mg） TNF-α/（pg/mg） SOD/（u/mg） MDA/（nmol/mg）假手术组 15 47.1±4.0 110.2±39.5 88.1±17.1 32.5±6.9 5.7±1.4脓毒症组 12 159.5±5.91） 359.5±20.51） 158.6±19.31） 59.0±9.21） 14.8±1.91）PDX 干预组 13 74.4±4.31）2） 162.4±51.31）2） 115.1±11.71）2） 38.7±6.21）2） 8.6±2.31）2）F值 1980.915 141.627 62.851 44.720 78.345 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各组小鼠肺组织胞核中NF-κB和胞浆中IκB-α蛋白表达比较 （±s）

表2 各组小鼠肺组织胞核中NF-κB和胞浆中IκB-α蛋白表达比较 （±s）

注：1）与假手术组比较，P ＜0.05；2）与脓毒症组比较，P ＜0.05

组别 例数 NF-κB蛋白 IκB-α蛋白假手术组 15 0.31±0.07 0.98±0.15脓毒症组 12 0.77±0.121） 0.30±0.071）PDX 干预组 13 0.51±0.141）2） 0.63±0.091）2）F值 55.675 123.909 P值 0.000 0.000

图2 各组小鼠肺组织胞核中NF-κB和胞浆中IκB-α蛋白表达

3 讨论

脓毒症作为烧伤、创伤、外科手术及缺血再灌注损伤等常见严重并发症，是导致患者死亡的重要因素[8]，研究表明[9]，脓毒症所致难以控制的全身炎症反应，最终导致的多器官损伤是导致患者早期死亡的主要原因。肺作为发生脓毒症时最易受损的靶器官，近年来虽然各种诊疗技术不断进步，但脓毒症所致急性肺损伤仍是主要死亡原因[10]，是目前危重医学亟需解决的难题。有研究指出[11]，脓毒症引发的全身炎症及大量炎症因子释放导致的氧化/抗氧化失衡是发生急性肺损伤的主要因素。PDX作为多不饱和脂肪酸经脂氧合酶代谢产物，在减少炎症反应及相关细胞因子释放中发挥重要作用[12]，戴昳宁[13]指出，PDX可降低叔丁基过氧化氢诱导的炎症及炎症相关细胞因子释放，减轻视网膜色素上皮细胞氧化损伤。本研究利用文献[5]中经典方法构建脓毒症所致小鼠急性肺损伤模型，病理学检查结果显示，脓毒症组小鼠肺组织出现典型的急性损伤改变，且肺组织损伤组织学评分显著增加，表明成功构建脓毒症所致小鼠急性肺损伤模型。

IL-1β、IL-6及TNF-α作为机体内主要的促炎因子，其水平与体内炎症反应水平呈正相关，可反应机体炎症反应水平[14]，MDA作为脂质过氧化反应产物，是反应机体内氧自由基生成及活性的主要指标，而SOD作为一种保护性物质，则在保护细胞免受氧自由基损伤中发挥重要作用[15]。本研究显示，与假手术组比较，脓毒症组和PDX干预组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平均升高，说明脓毒症所致急性肺损伤时，肺组织发生氧化应激和炎症反应，而在给予PDX干预后，小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD及MDA水平均降低，说明PDX可减少小鼠肺组织中炎症因子及氧化应激反应，病理学检查亦显示，PDX干预组小鼠肺组织病变较脓毒症组减轻，且肺组织损伤组织学评分降低，进一步说明PDX可通过抑制小鼠肺组织炎症及氧化应激反应而减轻脓毒症所致急性肺损伤。

有研究指出[16]，NF-κB可通过调控炎症因子释放而参与急性肺损伤发生。正常情况下，未活化的NF-κB与抑制蛋白IκB结合而游离于胞浆中，当受到外界刺激时，IκB发生降解而与NF-κB解离，NF-κB快速移至细胞核内，在于特异性靶位结合后，促进多种炎症因子和介质大量释放[17]。本研究显示，与假手术组比较，脓毒症组和PDX干预组小鼠肺组织胞核中NF-κB蛋白相对表达量均升高，而胞浆中IκB-α蛋白相对表达量均降低，说明发生脓毒症时可导致肺组织胞浆中IκB-α蛋白解离而使胞核中NF-κB蛋白大量增加，引发炎症反应，从而导致肺组织发生急性损伤，而在给予PDX干预后，PDX干预组小鼠肺组织胞核中NF-κB蛋白相对表达量均降低，而胞浆中IκB-α蛋白相对表达量均升高，说明PDX可能通过减少胞浆中IκB-α蛋白降解而阻止胞核中NF-κB蛋白，从而减轻炎症因子释放，发挥肺保护作用。

综上所述，PDX可减轻脓毒症所致小鼠肺组织损伤，其机制与减轻氧化应激反应及通过调控NF-κB/IκB-α通路而抑制炎症因子释放有关。

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