清毒提取液对脓毒症大鼠肠黏膜屏障功能保护作用的研究*

宋欠红 樊 睿 朱虹江 李云华 苏玉杰 邓远芬 赵 淳

（云南中医学院临床医学院，云南 昆明 650021）

脓毒症（sepsis）是临床难治病、多发病［1］。 在重症患者中发病率高，耗费大量医疗资源。尽管医疗技术日渐进步，但病死率仍高达30%~70%［2］。大部分脓毒症患者临床表现有发热，属中医学“外感热病”“温毒”等范畴［3］。脓毒症常引起肠道功能紊乱，肠壁充血水肿、坏死、肠黏膜破坏，导致大量内毒素释放入血，引起脓毒血症［4］。中医药治疗脓毒症可通过多途径、多环节、多靶点发挥治疗作用［5］。清毒提取液是全国名中医赵淳教授治疗脓毒症热毒蕴结、阳明腑实证的常用方剂，临床疗效显著。其组方原则主要是根据脓毒症主要病机为菌、毒、炎浸淫三焦，三焦热盛，热毒内侵，阳明腑实所确定的［6］。本实验通过观察清毒提取液对脓毒症大鼠小肠组织病理学改变，及对血清肠型脂肪酸结合蛋白（IFABP）、D-乳酸水平的调节，探讨其对脓毒症大鼠肠黏膜屏障功能保护作用［7-9］，观察血清谷丙转氨酶（ALT），尿素氮（BUN），肌酐（Cr）水平，研究其对肝肾功能的保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性Wistar大鼠90只，体质量 260～300 g，许可证号：SCXK（滇）2015-0003，大鼠合格证号：430067000007126，由昆明医科大学动物中心提供。大鼠自由饮水进食，实验前1周在实验环境中饲养。饲养条件：温度（22±2）℃，湿度40%~70%。

1.2 试药与仪器 清毒提取液制备，具体组方为生大黄 15 g，炒黄连 15 g，炒黄芩 10 g，黄柏 10 g，栀子15 g［10-11］。 以上 5味，共 10剂剂量。 药物浸泡 30 min，水煎2次，首煎生大黄后下10 min。加6倍量水，每次煎20 min，2次药液混匀。减压浓缩经0.2 μm过滤器过滤并调整质量浓度至1 g/mL（按生药计算）［12］。由云南中医学院临床医学院制剂室提供。注射用乌司他汀购自广东天普生化医药股份有限公司。D-乳酸试剂盒购自上海新睿生物科技有限公司，IFABP试剂盒购自上海晶抗工程有限公司，BUN试剂盒购自北京绿源伯德生物科技有限公司，以上3种采用ELISA检测。ALT试剂盒购自上海朝瑞生物科技有限公司，赖氏比色法检测。Cr试剂盒购自上海吉如生物科技有限公司，肌氨酸氧化酶比色法检测。主要仪器：FA/JA型电子天平（上海方瑞仪器有限公司生产）；723 SPC型分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司生产）；PSD800型离心机（苏州星亿机械有限公司生产）。

1.3 造模与分组 将大鼠用数字表法随机分为6组，分别为假手术组（n＝10）、模型组（n＝10）、乌司他汀组（n＝10）、清毒提取液低剂量组（n＝20）、清毒提取液中剂量组（n=20）和清毒提取液高剂量组（n＝20）。动物模型制作参照陆焱等［16］报道的方法基础上进行改良，复制腹腔感染型脓毒症大鼠模型。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠。在下腹部正中切长约2 cm切口，分离盲肠与大肠的系膜，将肠腔内粪便挤向远端，用灭菌3号丝线结扎盲肠，保持肠道通畅。在结扎范围内用12号针头穿刺两次肠壁，形成肠瘘，两个针孔相距约3 mm，为防止伤口愈合在第2针孔内放置一条宽2 mm的橡胶引流片。关闭腹腔，逐层缝合。为补充手术过程中体液的丢失术后立即皮下注射生理盐水，剂量1 mL/100 g体质量。假手术组只打开腹腔，不做盲肠造瘘，然后逐层缝合腹壁。

1.4 给药方法 清毒提取液成人每日用量为65 g，实验大鼠与成人用药量按照成人与大鼠体质量比例计算，方法：成人用量（以体质量 70 kg计）×0.0026×50=大鼠用量/体质量（kg）［13-14］。清毒提取液低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予 4.25、8.5、17 mL/kg。于盲肠结扎穿孔术前1 h和术后24、48、72、84 h分别给大鼠清毒提取液灌胃、0.9%氯化钠注射液灌胃、乌司他汀静脉注射。假手术组和模型组予以0.9%氯化钠注射液10 mL/kg灌胃。乌司他汀组予以注射用乌司他汀13000 U/kg尾静脉注射［15］。注射用乌司他汀10万单位加入0.9%氯化钠注射液10 mL，使用41/2针头，左侧尾静脉注射。

1.5 标本采集与检测 于盲肠结扎穿孔术后96 h使用10%水合氯醛（2.4 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉生效后，将大鼠仰卧位固定。于股动脉处取血约3 mL，待血液在试管中自然凝固后，予以离心，取上清液即血清分装于ependor管置于-20℃冰箱，进行检测。取回盲部上段3 cm处回肠组织为取材处，剪取回肠肠管长约1.5 cm，用0.9%氯化钠注射液将肠管冲洗干净，用4%多聚甲醛浸泡固定，用于制作石蜡切片。依次使用75%，80%，95%，100%梯度酒精脱水，二甲苯脱蜡、苏木素-伊红素染色制作切片标本，光学显微镜下观察病理变化［17］。

1.6 统计学处理 应用SPSS21.0统计软件。计量资料以（±s）表示，计量资料采用 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小肠组织病理学改变 见图1。光镜下可见，假手术组肠上皮细胞无破坏，无缺损，小肠黏膜完好，绒毛排布规整。模型组小肠上皮细胞有脱落，坏死，连续性中断，绒毛排列紊乱，炎症细胞浸润，毛细血管出血。乌司他汀组小肠黏膜不完整，肠上皮细胞有坏死，小肠绒毛增粗，有缺损和断裂。清毒提取液高剂量组，肠上皮细胞破坏较模型组轻，小肠绒毛排列欠整齐，有缺损，毛细血管出血。

图1 各组小肠组织病理学改变（HE染色，200倍）

2.2 各组大鼠血清IFABP、D-乳酸水平比较 见表1。清毒提取液低、中、高剂量组与模型组比较，均可以明显降低IFABP水平（P＜0.05）；清毒提取液中、高剂量组与模型组比较，可以明显降低D-乳酸水平 （P＜0.05）；清毒提取液低、中、高剂量组与乌司他汀组比较，IFABP、D-乳酸水平差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组血清IFABP、D-乳酸水平比较（±s）

表1 各组血清IFABP、D-乳酸水平比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05。下同。

组 别 n I F A B P （n g/m L） D-乳酸（m m o l/L）假手术组 1 0 1 3.0 3±2.2 6 0.5 5±0.0 5模型组 7 2 9.2 8±5.0 5 1.4 7±0.2 2乌司他汀组 1 0 1 8.5 9±3.2 4 0.8 2±0.1 3清毒提取液低剂量组 1 1 1 7.1 1±4.2 2* 1.1 1±0.2 8清毒提取液中剂量组 9 1 7.6 7±3.7 7* 0.7 6±0.1 2*清毒提取液高剂量组 9 1 6.8 9±4.0 1* 0.7 4±0.1 1*

2.3 各组大鼠血清ALT、BUN、Cr水平比较 见表2。清毒提取液低、中、高剂量组与模型组比较，均可以明显降低ALT水平（P＜0.05）；清毒提取液低、中、高剂量组与模型组比较，可以明显降低BUN水平（P＜0.05）；清毒提取液低、中、高剂量组与模型组比较，可以明显降低Cr水平（P＜0.05）；清毒提取液低、中、高剂量组与乌司他汀组比较，ALT、BUN、Cr水平差异均无统计学意义。

表2 各组 ALT、BUN、Cr水平比较（±s）

表2 各组 ALT、BUN、Cr水平比较（±s）

组 别 n A L T（U/L）假手术组 1 0 2 3.7 4±5.5 6模型组 7 1 6 5.3 1±1 6.4 3乌司他汀组 1 0 1 2 3.6 2±1 0.2 4清毒提取液低剂量组 1 1 1 3 0.5 2±1 2.2 8*清毒提取液中剂量组 9 1 3 6.8 7±1 0.7 7*清毒提取液高剂量组 9 1 2 5.3 2±1 1.0 1*B U N（m m o l/L） C r（μ m o l/L）5.7 0±1.0 2 5 3.6 4±6.3 2 1 9.1 1±3.2 3 2 2 1.3 1±1 9.7 6 1 1.0 2±2.2 4 1 4 8.2 5±1 3.4 7 1 0.2 5±2.0 9*1 3 3.8 3±1 2.6 1*1 1.5 4±2.7 4*1 4 0.5 0±1 3.9 9*9.1 8±2.5 5*1 3 6.6 9±1 3.2 5*

3 讨 论

脓毒症所致的肠黏膜破坏，肠壁充血水肿、坏死，是引起肠功能障碍的主要原因。应用盲肠结扎穿孔法复制的脓毒症模型，其脓毒症机制符合热毒蕴结阳明大肠，阳明热盛、腑实的特点。因肠道有多种细菌，形成肠瘘后，细菌快速繁殖，并产生大量内毒素，故脓毒症发生急剧、严重。脓毒症大鼠肝、肾功能受到严重损伤，是造成死亡的主要原因。至实验结束时，大鼠死亡分别达到假手术组0/10，模型组13/20，乌司他汀组10/20，清毒提取液低、中、高剂量组分别达到9/20，11/20，11/20，其发病急，死亡率高，与临床观察的发病状况相似。

清毒提取液为黄连解毒汤加大黄而成，以大黄、黄连、黄芩、黄柏、栀子按比例（3∶3∶2∶2∶3）组方［18-19］。 不仅泻火解毒力强，而且有引热下行之功，使热邪从大肠而泄，能荡涤阳明热邪，对湿热瘀毒壅滞胃肠有明显疗效，对减轻肠黏膜损伤有显著作用。D-乳酸是由肠道内多种细菌如乳酸菌、克雷伯杆菌、大肠杆菌等产生的，正常情况下并不产生该物质。当肠道黏膜受损时，血清D-乳酸水平明显升高，故血清中D-乳酸水平升高程度与肠黏膜损害程度呈正相关。肠型脂肪酸结合蛋白能够反映肠上皮细胞的通透性，当脓毒症时，肠黏膜损伤，细菌移位，肠上皮细胞通透性增加，肠型脂肪酸结合蛋白释放入血，IFABP水平升高。本实验中清毒提取液中、高剂量组与模型组比较，均可以明显降低IFABP、D-乳酸水水平，提示清毒提取液能够改善肠黏膜的损伤，降低肠上皮细胞的通透性，以减少细菌、毒素从肠道吸收入血液。模型组ALT、BUN、Cr与假手术组比较均有数倍的增高。模型组ALT、BUN、Cr分别为假手术组的7、3、4倍，表明脓毒症时肝肾功能严重受损。而清毒提取液能有效降低ALT、BUN、Cr水平，减轻脓毒症对肝肾功能的损害。

清毒提取液组方具有清热解毒、泻火攻下，荡涤湿热毒邪之功，属釜底抽薪之法。三黄清解三焦火毒，栀子引邪从小便而出，大黄泻火攻下，清解阳明热毒，荡涤湿热毒邪。现代药理研究发现［20］，黄芩具有解热、抑菌、抗炎、保肝、抗氧化作用。黄连具有广泛抗菌作用，有解热、抗炎、保肝、利胆作用。黄柏具有抗炎、抑菌、抗变态反应作用。栀子具有解热、抗炎、抗内毒素作用。大黄能增加肠蠕动、促进排便，有抗炎、抑菌、保肝利胆，改善血液循环，保护肠屏障功能调节免疫作用。其机理可能是全方发挥解热、抑菌、抗炎、抗内毒素、保肝、利胆、保护肠屏障功能调节免疫协同作用的结果。本实验初步显示，清毒提取液是治疗脓毒症的有效方法，能够减轻肠黏膜损伤，减轻肝肾损伤，防止肝肾功能随着脓毒症的加重而进一步恶化。其更深入的作用机理有待进一步研究。

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