山东省小麦土传花叶病毒病的分布与病原鉴定

吴 斌，姜珊珊，张 眉，王升吉，赵玖华，徐德坤，辛相启

(1.山东省农业科学院植物保护研究所，山东济南 250100；2.临沂市植物保护站，山东临沂 276000)

小麦土传花叶病毒病是危害冬小麦的一种重要病害，该病害由禾谷多黏菌(PolymyxagraminisL.)以持久性方式传播。感病小麦植株症状表现为叶片褪绿、黄化，分蘖减少，植株矮缩，拔节、返青期推迟，成穗率低，一般可造成减产30%左右，发病严重时达50%以上，甚至绝产[1]。小麦土传花叶病毒病于1958年在中国山东省荣成市埠柳镇不夜村首次被发现，自20世纪70年代，该病害发生逐年加重，引起了广泛重视[2-3]。其病原主要是小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus，WYMV)、中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus，CWMV)、小麦梭条斑花叶病毒(Wheat spindle streak virus, WSSMV)和土传小麦花叶病毒(Soil-borne wheat mosaic virus，SBWMV),在我国，没有发现WSSMV和SBWMV[4-7]。WYMV是大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)成员，主要分布在河南、山东、江苏、陕西、湖北、安徽6省[8]；CWMV为真菌传杆状病毒属(Furovirus)成员[9]，主要分布在山东胶东半岛、江苏大丰等冬小麦产区[10-12]。

近年来随着作物耕作制度和推广品种抗性变化，小麦土传花叶病毒病已成为河南、山东、江苏和安徽等省市小麦生产中存在的重要问题，全国常年发生面积约200万hm2，严重威胁中国小麦安全生产。2009年小麦土传花叶病毒病在山东临沂、枣庄等地突发，且有蔓延加重趋势；2012年山东全省发病面积约5 600 hm2，毁种面积86.7 hm2；2013年全省发病面积达6 600余hm2；2014年仅临沂市发病面积就达4 000 hm2左右，枣庄市发病面积约3 330 hm2，给当地小麦生产带来巨大损失[13]。小麦土传花叶病毒病的发生、流行受品种抗病性、气候条件和栽培方式等多种因素的影响，目前有效的防治方法是使用抗病品种[14-15]。在小麦品种推广过程中，由于对小麦品种抗该病害的抗性评价重视不够，造成感病品种在病区大面积种植，促使病害蔓延流行[16]。山东冬小麦种植区环境差异较大，栽培方式复杂多样，品种抗病性差异大，CWMV可能存在更多不同的致病株系[17]。针对山东省小麦土传花叶病毒病的分布、毒原鉴定等尚缺乏系统研究。本研究于2013-2016年基于田间调查，结合斑点酶联免疫吸附测定法(dot-Enzyme linked immunosorbent assay, dot-ELISA)和反转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)检测法，对山东省小麦土传花叶病毒病的分布、主要的病原种类以及CWMV的系统进化进行分析，以期为该区小麦品种的合理布局提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 田间调查与样品采集

于2013-2016年每年3月中上旬至4月上旬，在小麦土传花叶病毒病发生盛期，对山东省小麦主要种植区的70多个县市进行该病害发生危害情况调查，采集疑似病毒侵染的小麦样品512份，放入超低温(-80 ℃)冰箱冷冻保存，用于病毒病原检测。

1.2 Dot-ELISA检测

对采集的疑似病样进行dot-ELISA检测，以健康小麦(济麦22)叶片为阴性对照，以缓冲液为空白对照。样品按1∶10(w/v)加入磷酸盐缓冲液，研磨成浆，8 000 r·min-1离心3 min，取上清即为待检样品。一抗分别为WYMV和CWMV抗兔血清(由浙江省农科院病毒与生物技术研究所馈赠)，二抗为羊抗兔IgG-碱性磷酸酶(Sigma公司，美国)。

1.3 小麦样品总RNA的提取

称取冷冻小麦样品材料0.1 g放入盛有液氮的研钵中研磨成粉末，加入1 mL Trizol溶液(Invitrogen公司，美国)剧烈振荡，室温静置10 min；加入200 μL氯仿剧烈振荡，室温静置5 min；12 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，取上清；加入600 μL异丙醇，室温静置15 min；12 000 r·min-1、4 ℃离心15 min；用75%(v/v)乙醇洗涤两次，8 000 r·min-1、4 ℃离心5 min；加入适量DEPC处理双蒸水(DNase/RNase-free ddH2O)，65 ℃溶解RNA 10～15 min，-80 ℃保存。同时提取健康小麦叶片总RNA作为健康对照。

1.4 RT-PCR检测

根据已报道的WYMV和CWMV外壳蛋白基因序列设计特异性引物(表1)，以提取的待检样品总RNA为模板进行反转录，在RNase-free的0.2 mL离心管中依次加入总RNA 5 μL，Random Primer 1 μL，DEPC-treated ddH2O 6 μL，65 ℃水浴5 min后迅速置于冰上，加入5×buffer 4 μL，dNTPs(10 mmol/L) 2 μL，RNase Inhibitor 1 μL，M-MLV reverse transcriptase 1 μL，25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 5 min，反应得到的cDNA保存于-20 ℃。

取cDNA 1 μL，加入10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs(10 mmol/L) 2 μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，Taq酶(5 U/ μL)0.25 μL，ddH2O补足至25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 WYMV和CWMV的特异引物Table 1 Primers for wheat yellow mosaic virus and Chinese wheat mosaic virus in this study

1.5 PCR产物的回收、克隆及分析

利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit，TransGen Biotech, 北京)回收目的片段，并与pMD18-T载体(Takara，日本)进行连接、转化，挑取阳性克隆，通过PCR鉴定后，送样于生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。借助软件DNAstar(ver. 7.10)和BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行基因同源性分析，利用MEGA 5软件邻接法(Neighbor-Joining，NJ)对选定的CWMV的CP(coat protein)基因序列构建系统进化树，进化树中各分支置信度(Bootstrap)进行1 000 次重复分析。

2 结果与分析

2.1 小麦土传花叶病毒病的病原种类

对2013-2016年采集的疑似小麦土传花叶病毒病样品进行dot-ELISA检测结果(图1，图2，表2)表明，山东小麦土传花叶病毒病的病原为WYMV和CWMV。对dot-ELISA检测结果为WYMV和CWMV阳性的样品进行RT-PCR检测，结果表明，WYMV阳性的样品均扩增出约740 bp的特异条带(图3)，与预期目的片段长度一致；CWMV阳性样品中均扩增出大小约375 bp的特异条带，与预期的目的片段长度一致，WYMV和CWMV阴性样品和健康植株叶片均未扩增出相对应的特异条带。

点阵A1～A11、B1～B11、C1～C8、D1～D11和E1～E11为鲁南地区52个样品；点阵C9、C10和C11分别为阳性、阴性和空白对照。

A1-A11, B1-B11, C1-C8, D1-D11 and E1-E11 were 52 diseased samples from the south of Shandong. C9,C10 and C11 were positive control, negative control and blank control, respectively.

图1小麦土传花叶病毒病病叶部分样品WYMV的dot-ELISA检测结果

Fig.1ImageofWYMVdetectedinthediseasedleafsamplesbydot-ELISA

A1～A11、B1～B11、C1～C11和D1～D8为鲁东41个样品；D9、D10和D11分别为阳性对照、阴性对照和空白对照。

A1-A11, B1-B11, C1-C11 and D1-D8 were 41 samples from the east of Shandong province; D9, D10 and D11 were positive control, negative control and blank control, respectively.

图2山东省小麦土传花叶病毒病部分样品CWMV的dot-ELISA检测结果

Fig.2ImageofCWMVdetectedindiseasedleafsamplesbydot-ELISA

2.2 WYMV和CWMV在田间的分布

dot-ELISA检测和RT-PCR检测的结果(表2，图4)表明，小麦土传花叶病毒病主要分布在鲁南地区，鲁东、鲁中和鲁北地区均有零星分布。临沂市、枣庄市、济宁市、泰安市、潍坊市、日照市、淄博市和济南市的主要病原为WYMV，其中在济南市长清区首次检测到WYMV。CWMV主要分布在烟台市、威海市、青岛市、德州市和临沂市，其中德州市平原、临沂市沂水县和莒南县为CWMV新发现的病区。烟台市福山区、威海市荣成市、文登市、青岛市胶州市和临沂莒南县检测到此两种病毒复合侵染。在潍坊昌邑、青岛平度等早期报道的病区，并未检测出小麦土传花叶病毒病。

表2 山东小麦土传花叶病毒病dot-ELISA检测结果Table 2 Result of wheat soil-borne virus disease in Shandong province by dot-ELISA

A:WYMV的RT-PCR检测；B:CWMV的RT-PCR检测； 1～12:12个样品；M:DL2000Marker；N:阴性对照。

A:Image of WYMV tested by RT-PCR; B:Image of CWMV tested by RT-PCR; 1-12:12 samples; M:DL2000 Marker; N:Negative control.

图3WYMV和CWMV部分RT-PCR检测结果

Fig.3ImagesofpartRT-PCRforWYMVandCWMV

图4 WYMV(■)和CWMV(▲)在山东的分布情况

2.4 CWMV的进化分析

对分属于7个地市的CWMV阳性样品进行CP基因全序列克隆及测序分析，结果表明，扩增得到的CP基因有531个核苷酸，编码176个氨基酸。对获得的序列进行聚类分析发现，7个被测CP基因的同源性为94.7%～98.3%。

对所获得的7个分离物和已报道的CWMV构建CP基因系统进化树，结果(图5)表明，烟台福山(YT)、文登(WD)、平原(PY)、莒南(JN)4个分离物与日本分离物(GenBank accession No.:AB299272.1)聚类为一簇；荣成(RC)、胶州(JZ)、沂水(YS)与江苏分离物(JS2006)聚类为一簇，所形成的分枝与地理来源无明确关系。

3 讨 论

小麦土传花叶病毒病是近年来危害山东冬小麦生产、且呈逐年加重趋势的重要病害，研究该病害的分布和病原种类可为小麦抗病品种的合理布局和病害防控提供依据。本研究通过田间调查，结合dot-ELISA和RT-PCR检测方法，系统分析了小麦土传花叶病毒病在山东省的最新发生状况与地理分布及各病区的病原种类。发现小麦土传

YT:烟台株系；WD:文登株系；PY:平原株系；JN:莒南株系；RC:荣成株系；JZ:胶州株系；YS:沂水株系。

JN:Junan strain; PY:Pingyuan strain; YT:Yantai strain; WD:Wendeng strain; YS:Yishui strain; JZ:Jiaozhou strain; RC:Rongchen strain.

图5CWMV中CP基因的临近法系统进化树

Fig.5PhylogeneticanalysisoftheCWMVCPgenesbyNeighbor-Joining

花叶病毒病在鲁南、鲁东、鲁中和鲁北地区均有分布，其中，鲁南地区仍为小麦土传花叶病毒病的主要发病区，德州平原和济南长清为新发现病区；临沂沂水、莒南地区由早期报道的WYMV单独侵染发展为WYMV与CWMV复合侵染。总体上来讲，该病害在山东省发病呈蔓延传播趋势。

小麦土传花叶病毒病的发生与耕作方式和气候等多个因素密切相关。调查发现，同一地点不同年份该病害发病情况存在明显差异。此外，小麦推广品种的抗病性也是影响小麦土传花叶病毒病分布的重要因素[18-20]。在WYMV发生较为严重的临沂和枣庄地区，种植的小麦品种多为易感病品种临麦4号，而在潍坊昌邑等老病区，由于近年来推广的小麦品种多为抗病品种济麦22[21]，因此，该病害在此地区发生呈减弱趋势。目前，在小麦品种的选育、区试和推广过程中，缺乏对小麦土传花叶病毒病的抗性评价，大面积推广和种植感病品种后，造成小麦土传花叶病毒病大规模发生流行，发病区域范围扩大。同时，粘附病菌的麦种通过种子调运和农业机械大范围跨区作业途径加剧了该病害的蔓延传播。因此，加强对小麦品种抗小麦土传花叶病毒病抗病性评价尤为重要，特别是在病害重发区。明确小麦主栽品种抗病性，筛选高抗品种资源，因地制宜，提出适合不同地区的小麦土传花叶病毒病防控体系，科学指导小麦抗病品种的种植和推广，加强调种、引种机制及农机大范围跨区作业制度的规范管理，可有效控制小麦土传花叶病毒病的发生和蔓延，为该病害合理有效的防控提供保障。

对山东省7个地市CWMV的CP基因的克隆丰富了基因资源库，为小麦土传花叶病毒病的病原群体动态积累了资料。CWMV 的CP基因的系统进化分析表明，山东省各个病害样品分离物的基因序列一致率较高，同源性大于90%；基因聚类结果表明，分离物与地域来源并无明确关系。进一步开展对不同地区CWMV的遗传结构研究分析，以明确病毒的进化机制，对预测病害的流行趋势和制定有效的控制措施均具有指导意义。

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