短密木霉、咪唑乙烟酸和种植大豆对土壤真菌多样性及农药残留的影响1)

李志国 霍璐阳 刘宇彤 刘晴 董爱荣

(东北林业大学，哈尔滨，150040)

当今社会，农药在农田耕作中起着十分重要的作用，但是农药的施加会产生一定量的农药残留，对农作物造成一定的影响，这一问题已经引起社会的高度重视[1]。所以，近年来利用微生物降解除草剂、杀虫剂等农药的研究得到了科学界的关注，并且也分离出一些高效降解菌[2-5]。在农业生产中，除草剂被广泛地应用[6]，其中咪唑乙烟酸活性高、用量低、选择性广等优点，在农业市场中占有重要的地位[7]，但由于咪唑乙烟酸在土壤中残留时间长，易对后茬作物玉米、蔬菜、棉花、高粱、油菜、甜菜、马铃薯等造成药害[8]。微生物降解是除草剂主要的降解途径[9]，微生物不仅对土壤中咪唑乙烟酸具有降解作用，同时对土壤中的微生物的数量、种类也具有显著的影响。本研究将1株对咪唑乙烟酸有高效降解作用的菌株施加在土壤中，定期测定土壤中的农药残留量、真菌数量及种类的变化。土壤真菌多样性与短密木霉、咪唑乙烟酸、大豆之间存在着相互关系，研究试验前后土壤真菌多样性的变化，对于深入理解修复对土壤真菌的影响作用机制具有较重要的理论意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

盆栽模拟试验土壤为m(草炭)∶m(沙子)∶m(土)=5∶3∶2的比例进行混合所得。大豆品种是黑农48，菌种是试验前期驯化得到的高效降解菌株短密木霉(Trichodermabrevicompactum)。

培养真菌的培养基采用孟加拉红培养基：蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、磷酸二氢钾1.0 g、硫酸镁0.5 g、琼脂20.0 g、1/3 000孟加拉红溶液100 mL、蒸馏水1 000 mL、氯霉素0.1 g。

保存菌株采用PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 盆栽模拟试验

将短密木霉接种于60个PDA平板中，放入培养箱，25 ℃、黑暗条件下培养5 d。待菌株大量产孢后，将菌丝连同孢子刮下，加入到盛有无菌水的烧杯中，放入少量的吐温80，用玻璃棒充分的搅拌，均匀地混入部分试验用土壤中。

将部分试验用土壤加入不等量的5%咪唑乙烟酸水剂，分别制成咪唑乙烟酸质量分数为50、100、150 mg/kg的污染土。

选择籽粒饱满、均匀、无病虫的大豆种子，每盆摆15粒，覆土2.0 cm，放在盆栽内自然生长。

按表1设计盆栽试验，每个试验组设置3个重复，种植于东北林业大学温室大棚中。盆栽处理后第5天、第10天、第20天、第30天、第40天分别用五点法取土样，风干，过10目筛，放入冰箱4 ℃保存待用。

表1 盆栽模拟试验处理组合

1.2.2 土壤真菌的分离、纯化及计数

取处理5、10、20、30、40 d的土样，分别称取5.0 g干土放入45 mL无菌水中，稀释10倍，室温下160 r/min摇床中振荡20 min。取1 mL的土壤悬浊液加入到盛有9 mL无菌水的无菌试管中，反复吸打，稀释到102倍，循环操作至103倍。分别吸取103的稀释液40 μL移到孟加拉红平板中，用涂布器涂抹均匀，用封口膜封口，培养箱里25 ℃培养。样品设5个重复。根据培养后真菌的菌落形态特征(菌落颜色、大小、厚度、致密程度以及质地等)进行比较区分编号，将所有形态不同的菌落进行计数，并分别转接到试管斜面上，置于恒温培养箱中25 ℃培养，长满后置冰箱中4 ℃保存备用。

每克干土中真菌数量=(菌落平均数×稀释倍数)/干土质量；同时计算短密木霉的数量比例，短密木霉的数量比例=(短密木霉的数量/总真菌数)×100%。

1.2.3 土壤真菌的鉴定

纯化培养分离获得的每个真菌菌落，纯化后在显微镜下观察菌丝体和子实体等结构的形态特征。对不产生子实体的菌落进行光照、黑暗交替或低温处理，诱发其产生休眠体或繁殖结构。根据形态特征将真菌鉴定到种[10-12]。

1.2.4 土壤中农药残留的测定

取5.0 g土加入到V(甲醇)∶V(碳酸钠水溶液)=1∶1的混合溶液中，用漩涡振荡器震荡1 min，3 750 r·min-1离心10 min，取上清液2 mL，加入无水硫酸钠、活性炭以及300 μL盐酸。震荡1 min，5 000 r·min-1离心5 min，用0.22 μm有机滤膜过滤，待HPLC检测。

以Agilent ZORBAX Extend-C18柱作为分离分析柱，流动相为V(0.05%冰乙酸乙腈)∶V(0.4%冰乙酸水溶液)=40∶60，柱流速1.0 mL·min-1，柱温室温，进样量10 μL，检测波长254 nm，保留时间6.2 min[13]。

2 结果与分析

2.1 短密木霉、大豆和咪唑乙烟酸对土壤真菌多样性的影响

由表2得知，在培养期间，对照组(CK)的真菌数量逐渐增多，在20 d真菌数量最多，其后有所降低，这可能与当时试验期间的温度变化有关。在培养期间，真菌的种类无明显变化。A1与CK的真菌数量、种类均无显著性差异，说明大豆根系对真菌的数量、种类影响不明显。A2与CK的真菌数量、种类差异显著(P<0.05)，说明加入短密木霉后，对其他真菌具有抑制的作用，且短密木霉的数量在培养时间内逐渐增多，20 d达到最高。A3、A4、A5与CK的真菌数量具有显著性差异(P<0.05)，0～20 d真菌数量明显减少，农药浓度越高，真菌的数量越少，30 d后真菌的数量逐渐恢复到对照组水平。A3、A4、A5农药质量分数对种类影响不大。A6、A7、A8与CK的真菌数量、种类具有显著差异(P<0.05)，真菌数量明显增加，真菌种类明显减少。

2.2 土壤真菌的鉴定结果

采用稀释平板法对土壤样品进行真菌分离。根据菌落形态，初步纯化得到35个不同真菌菌株，鉴定出13属20种，包括链格孢菌(Alternariasp.)、枝顶孢菌(Acremoniumsp.)、黄曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(A.niger)、曲霉菌(A. sp.)、螺卷毛壳(Chaetomiumcochliodes)、毛壳菌(Ch. sp.)、镰刀菌(Fusariumsp.)、粘帚霉属(Gliocladiumsp.)、腐质霉菌(HumicoLasp.)、被孢霉菌(Mortierellasp.)、毛霉菌(Mucorsp.)、拟青霉菌(PaeciLomycessp.)、变灰青霉(Penicilliumcanescens)、黑青霉(P.nigricans)、青霉菌(P. sp.)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、短密木霉、木霉菌(T. sp.)。其中，曲霉属、毛霉属、青霉属、木霉属真菌是土壤中常见的真菌，占真菌总数的61.5%。加入短密木霉后，曲霉属、青霉属、毛霉属真菌等土壤中常见的真菌虽然能从土壤中分离纯化出来，但数量明显减少，说明短密木霉对其他真菌有抑制作用。

表2 不同培养时间试验土壤中真菌的数量

注：表中真菌数量数据为平均值±标准差；同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。

2.3 短密木霉、大豆和咪唑乙烟酸对咪唑乙烟酸降解的影响

由表3可知，A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11处理组土壤中的咪唑乙烟酸质量分数随着处理时间的增加都逐渐的减少，10～20 d降解效率最高。A3、A4、A5处理组咪唑乙烟酸降解速度明显低于A6、A7、A8、A9、A10、A11处理组。加入高效降解菌短密木霉后，咪唑乙烟酸降解速度明显增加，说明其能发挥较好的降解作用。种植大豆后，10 d前，A6、A7、A8处理组与A9、A10、A11处理组降解率无明显差异，说明生长初期大豆吸附降解能力很弱；10 d后，前者略高于后者，说明大豆对咪唑乙烟酸具有一定的吸附降解能力。此外，咪唑乙烟酸质量分数也会影响自身的降解，其质量分数越高，对土壤微生物、大豆影响越大，降解速度降低。

表3 不同试验组对咪唑乙烟酸的降解率

3 结论与讨论

盆栽模拟试验结果表明，大豆对土壤真菌数量及种类影响不明显，短密木霉能抑制其他土壤真菌，培养期间真菌数量逐渐增多，20 d达到最高。咪唑乙烟酸对土壤真菌种类、数量明显抑制，其质量分数越高，真菌数量越少，20 d后真菌数量恢复到对照水平，试验组的农药质量分数对种类影响不大。三者互作与对照组的真菌数量、种类具有显著性差异，真菌数量明显增加，而种类明显减少。

土壤中的咪唑乙烟酸质量分数随着处理时间增加都逐渐的减少，10～20 d降解效率最高。短密木霉、大豆和咪唑乙烟酸质量分数都会影响咪唑乙烟酸的降解。

本研究表明，大豆单独对真菌数量的影响不显著，该结果与於丽华等[14]报道的大豆根系明显促进土壤细菌数量的增长，但对真菌数量的影响不明显的结果基本一致。石兆勇等研究表明，高浓度农药会降低真菌的数量[15]，这与本研究基本一致。在本研究中，短密木霉、大豆、咪唑乙烟酸三者互作对真菌数量、种类的影响也比较明显，大豆对真菌影响不显著，短密木霉与咪唑乙烟酸对其他真菌都起到了抑制的作用，而短密木霉具有降解农药的作用。

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