T细胞中的豪华轿车——CAR-T细胞*

王月丹 林怡婷

（北京大学基础医学院免疫学系 北京 100191）

在英语中，汽车被称为CAR，在T细胞中也有一种被称为CAR，这就是大名鼎鼎的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor）T 细胞， 简称为 CAR-T细胞。2017年8月30日，美国药品及食品管理局（简称FDA）批准了诺华公司的CAR-T细胞产品［1］——CTL019，用于治疗青少年和儿童急性淋巴细胞白血病，成为世界上首个商品化的CAR-T细胞产品。而CTL019治疗每位患者的定价则高达47.5万美元（约合300万人民币），几乎是顶级名车——法拉利488GTB在美国销售价格（约25万美元）的2倍。至少从价格的角度来说，将CAR-T细胞称为T细胞中的豪华轿车一点也不为过。如此昂贵的细胞究竟是什么？它又是如何工作的？

1 CAR-T细胞的工作原理——CAR的组成与功能

T细胞是人体免疫系统中最为重要的免疫细胞，在细胞免疫及免疫应答调节中，占有核心地位。一旦失去了全部或者部分T细胞，例如HIV感染引起的艾滋病状态时，人体的免疫系统及其功能就会崩溃，无法有效应对各种病原体及肿瘤细胞的攻击，最终导致患者死亡。T细胞是“胸腺依赖的淋巴细胞”的简称，是必须依赖胸腺才能发育成熟的一种适应性免疫应答细胞。在胸腺中，T细胞的前体细胞需要经过阳性选择才能发育成熟并获得对抗原信号的识别能力。在阳性选择中，只有能够与自身MHC（主要组织相容性抗原复合体）分子结合的T细胞才能继续发育和成熟，否则将会发生凋亡而被淘汰。这个过程的结果，也就使得未来成熟的T细胞识别抗原信号时，只能识别由自身MHC分子提呈的抗原信号，即MHC限制性。MHC限制性的存在，保证了T细胞识别抗原信号的精准性，但也使其对抗原信号的识别，需要高度依赖抗原提呈细胞对抗原信号的高效处理和加工过程。

在正常生理条件下，T细胞通过表面的TCR（T细胞抗原受体）识别由抗原提呈细胞表面MHC提呈的抗原信号和共刺激分子的作用下被激活，从而发挥免疫应答的功能［2］；但在肿瘤等病理条件下，由于肿瘤组织中的抗原提呈细胞（肿瘤细胞本身也可以作为一种抗原提呈细胞）MHC分子和共刺激分子的表达异常，导致T细胞无法有效识别肿瘤细胞的抗原信号，因此无法正确有效地活化，而对肿瘤细胞产生了免疫耐受，导致肿瘤细胞的免疫逃逸。在这种情况下，肿瘤组织中的T细胞不仅不能有效杀伤和清除肿瘤细胞，反而可能沦为肿瘤细胞等“黑恶势力”的保护伞，促进肿瘤的发生和发展。

CAR-T细胞是一种经过人工改造的基因工程化T细胞。最主要的特征是细胞表面具有由人工构建基因表达的嵌合抗原受体（CAR）。一般来说，CAR由胞外段、跨膜区和胞内段3个区域组成。其中，CAR的胞外段是抗原信号的识别区域，一般由抗体的V区或者其衍生片段组成，可以直接识别完整的具有空间结构的抗原表位，而不会像只有一个狭窄抗原结合槽的TCR那样只能识别由MHC结合的抗原肽信号。这使得CAR较TCR具有更加广阔的抗原表位识别范围。CAR的跨膜区与TCR的跨膜区功能一样，具有锚定作用，可以将CAR固定在T细胞膜上，使其稳定地发挥信号转导功能。CAR的胞内段则是具有信号转导功能区域，具有多个免疫受体酪氨酸激活基序 （immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM），能将CAR接收到的抗原信号，转化为活化信号，激活T细胞，使其增殖并分化为效应性的T细胞，发挥抗肿瘤等免疫应答效应。将编码上述3个部分的基因组合在一起，然后通过载体转染T细胞，使其在细胞膜上表达并发挥识别抗原信号的作用，即可成功完成CAR-T的制备。

CAR的设计和制备是CAR-T细胞制备技术的核心，而将CAR基因转染入T细胞，并获得CAR-T细胞则是CAR-T细胞制备的另一个关键技术。目前，将CAR基因带入T细胞常用的技术主要有2类：病毒转染和无病毒体系转染。其中，利用逆转录病毒和慢病毒作为载体，将CAR基因整合入宿主T细胞基因组，稳定地产生CAR-T细胞，是目前最为常用的CAR-T细胞制备方法。该方法的基本原理是：利用逆转录病毒（人类免疫缺陷病毒HIV也是其中一种）能将自身的基因组注入细胞并整合到宿主DNA分子中的能力，在体外HEK293细胞中包装制备携带CAR的病毒颗粒，再利用病毒自身的感染能力感染T细胞，并将CAR整合到T细胞基因组中，然后通过活化、扩增和筛选，获得稳定表达CAR的T细胞，即CAR-T细胞。以病毒转染获得的CAR-T细胞是临床应用的主要CAR-T细胞来源，目前通过FDA审批上市及临床研究的CAR-T细胞都是采用这种方法制备的。而无病毒体系转染获得CAR-T细胞则主要是通过电击的方法（电转法），改变细胞膜的通透性，使携带CAR基因的质粒等载体进入T细胞，并在细胞内表达CAR，从而获得CAR-T细胞。电转法由于细胞活率较低及转染细胞量较小等原因，目前基本只用于临床前的科研工作中。

2 CAR-T细胞的发展与应用

2.1 第1代CAR-T细胞 1987年,日本人Kuwana将编码抗肺炎链球菌R36A株的抗体可变 （V）区和TCR恒定（C）区的基因同时克隆和装入到表达载体中，并转染入EL4细胞（一种小鼠淋巴母细胞瘤细胞，具有某些T细胞的特征，表达CD3和CD28分子，可用于T细胞及其激活过程的研究）。然后，利用带有目标靶抗原的肺炎链球菌R36A株抗原，成功地激活了这个工人构建的细胞［3］。这就是CAR-T细胞的雏形。

经过20多年的发展，到目前为止，根据CAR的不同，可以将CAR-T细胞分为无共刺激信号CAR-T细胞（第 1代）、单一共刺激信号CAR-T细胞（第2代）、双/多共刺激信号CAR-T细胞（第3代）和精准CAR-T细胞（第4代）等4个发展阶段。这4代CAR-T细胞的胞外识别区都是抗体的V区或其衍生片段（如单链抗体V区片段，ScFV等等），跨膜区也并无很大区别，所以一般以CAR的胞内段结构进行它们的阶段划分。

第1代CAR-T细胞CAR的胞内片段结构比较简单［3-6］，一般是由TCR的恒定区片段或者CD3分子ζ链胞内段构成。TCR的恒定区并无ITAM区，只能通过募集结合CD3分子中的ζ链，并利用后者链内存在的ITAM区，激活T细胞。从本质上说，第1代CAR-T细胞是模拟天然TCR/CD3复合体的抗原信号激活T细胞。由于第1代CAR并不能同时提供T细胞活化所必须的共刺激信号，必须依赖T细胞自身与抗原提呈细胞的相互作用而获得的天然共刺激信号，所以其激活T细胞的效率较低，在临床免疫治疗中未能取得预期的理想效果［7］。

2.2 第2代CAR-T细胞 第2代CAR-T细胞的CAR较第1代复杂，其胞内片段不仅包括了CD3分子ζ链的ITAM区，而且还含有一个来自共刺激分子 CD28或者 CD137（4-1BB）的 ITAM 区，可以通过CAR接受抗原信号的刺激，同时获得抗原刺激信号和一个共刺激信号（来自CD28或CD137的信号转导通路）。这种CAR-T细胞活化的能力远远强于第1代CAR-T细胞，在临床实验研究中取得了令人振奋的治疗效果［8］。一般认为，含有CD28活化信号的CAR-T细胞能展示出更强的激活功能，类似于短跑选手的爆发力；而含有CD137信号的CAR-T细胞则具有更强的持久活化能力，类似长跑运动员的耐力。但是，由于第2代CART细胞使用的载体是逆转录病毒，其可容纳和携带的外源性基因片段长度有限，难以将2个共刺激信号基因同时装入，因此人们往往不得不在激活的强度和持久性中进行抉择。

2.3 第3代CAR-T细胞 第3代CAR-T细胞则是第2代CAR-T细胞的直接升级版，利用慢病毒作为载体，具有更大的外源性基因片段的容量，因此可以在包含了CD3分子ζ链的ITAM区后，仍然可以同时容纳2个或者2个以上的共刺激分子基因片段或者其他免疫分子片段（例如IL-12、IL-15和GM-CSF等细胞因子的基因）［9］。其中，有人也把具有2个共刺激分子基因和同时带有持续或可诱导表达的IL-12、IL-15或GM-CSF细胞因子基因的CAR-T细胞称为4代CAR-T细胞。但是，这种CAR-T细胞在原理上与第3代CAR-T细胞基本一致，只是载体容量更大，只能算是一种3代+或者3.5代的CAR-T细胞。与前2代CAR-T细胞，第3代CAR-T细胞展现出非常强大的免疫应答能力，可以迅速大量地清除患者体内的肿瘤细胞。但是，由于CAR中缺乏可控元件或者精准识别机制的设计，第3代CAR-T细胞治疗经常会引起炎症因子释放综合征等严重的不良反应，并存在导致肿瘤抗原脱靶而损伤正常细胞的潜在风险。

2.4 第4代CAR-T细胞 第4代CAR-T细胞也被称为精准CAR-T细胞。这一代的CAR-T细胞设计主要是从肿瘤等疾病的精准治疗角度考虑的。目前，CAR可以识别的肿瘤抗原均为CD19等肿瘤相关抗原，在肿瘤细胞表面表达但在某些正常细胞表面也可能有低水平的表达，这可能导致CAR-T细胞治疗的脱靶（损伤了正常细胞）问题。CAR-T细胞一般具有很长的寿命，可在患者体内生存5年以上，如此长的生存期虽然有利于CAR-T细胞彻底清除和控制肿瘤细胞，但另一方面也可能会在完全清除肿瘤细胞以后，对正常细胞产生伤害。为解决此问题，人们一方面构建了带有自杀基因或者可控性自杀基因（例如某些药物敏感基因）的CAR-T细胞，使CAR-T细胞在体内的行为能够自限或者可控，避免在清除肿瘤细胞后伤害正常组织细胞；另一方面，人们发明了双信号通路CAR-T细胞，分别将控制T细胞活化的2条不同信号通路的CAR（通常一条通过TCR/共刺激信号通路，另一条通过NOTCH信号通路）同时转染入T细胞，2条通路识别的肿瘤抗原是不同的。肿瘤细胞往往同时表达这2种抗原，而正常组织细胞只表达其中一种，当双信号通路CAR-T细胞遇到肿瘤细胞时，2个通路同时活化，而被激活，杀伤肿瘤细胞，而遇到正常细胞时，只有一个通路活化，不会杀伤正常的组织细胞，实现了CAR-T细胞识别的精准化［10］。然而，目前第4代的CAR-T细胞还多是一种停留在实验室科研阶段的概念性CAR-T细胞，在临床还未被广泛应用。

目前，CAR-T细胞已经被广泛应用于各种肿瘤的细胞免疫治疗中［11-13］。据统计，包括美国FDA在内的多个国家药监部门已经批准了多达300个以上的CAR-T细胞治疗临床实验的项目。来自这些临床实验治疗项目的统计数据表明，虽然由于使用了不同的CAR和T细胞来源与制备工艺，以及预处理和联合用药的差异，导致各个临床项目的效果存在一定差异，但总体显示，CAR-T细胞治疗肿瘤是有效的，其有效率为30%～70%，甚至可以高达90%以上。例如，FDA已经批准上市的诺华CTL019治疗非何杰金淋巴瘤的完全缓解率竟然达到了令人惊讶的93%。也许，CAR-T细胞治疗将彻底终结人类因肿瘤丧生的宿命。

3 CAR-T细胞治疗存在的问题及其对策

虽然，在多年的临床试验中，CAR-T细胞展现出了令人惊叹的理想效果，但在应用中，人们也发现了严重不良反应的发生、实体瘤应用困难、T细胞来源、载体问题及治疗的脱靶和耐药等一系列问题，影响和限制了其进一步的应用和推广。

从目前的临床实验数据看，CAR-T细胞治疗相关的细胞因子释放综合症（CRS）和神经系统不良反应，是CAR-T细胞治疗最为常见的严重不良反应。这2种不良反应极大降低了患者对治疗的耐受性，甚至可能危及患者的生命安全，因此必须认真处理和面对。其中，CRS的发生主要是由于患者体内存在的大量肿瘤细胞，在短时间内被CAR-T细胞大量杀伤，在局部和全身产生了大量的炎症激活物，使巨噬细胞和T、B淋巴细胞等免疫细胞大量释放炎症性的细胞因子，引起免疫系统过度活化，导致患者出现高热、低血压休克等一系列的全身炎症反应性症状。一般来说，CRS是可控和可防的。临床应用抗IL-6的单克隆抗体，可以极大减少甚至避免CRS的发生，并减轻其严重程度。在CRS过后，接受CAR-T细胞治疗的患者，往往还要面临该疗法的神经系统并发症的威胁。当发生此并发症时，患者脑部可发生水肿，并出现震颤、头痛、失语、幻觉、意识混乱、平衡失调和癫痫发作等神经系统症状，甚至导致患者的死亡。发生神经毒性的原因，目前尚不清楚，但有人推测是与患者脑部存在的肿瘤细胞，吸引了CAR-T细胞在脑部大量杀伤而释放炎性物质有关，因此建议糖皮质激素治疗可能有效。此外，CAR-T细胞还有可能引起恶心、乏力、肌肉酸痛、低氧血症、低血压和肾功能衰竭等其他不良反应。一般来说，对这些症状对症处理，即可缓解。当然，随着抗IL-6抗体和转移因子等T细胞功能辅助药物的应用和推广，CAR-T细胞的治疗效果和治疗相关的不良反应，都会得到进一步改善。

到目前为止，CAR-T细胞在实体瘤治疗中取得的效果远不如其在白血病等造血细胞来源的恶性肿瘤中的效果。这主要是由于实体瘤一般存在着阻碍CAR-T细胞进入的各种生物屏障，导致CAR-T细胞无法大量聚集在肿瘤组织的深处，从而影响CAR-T细胞的免疫治疗效果。为解决此问题，人们一方面通过生物学技术，将编码肿瘤组织靶向的趋化因子受体和黏附因子的基因组合到CAR中，使CAR-T细胞能够趋化、迁移和进入实体瘤中，发挥抗肿瘤效应；另一方面，则采取物理方法，利用微导管，结合影像学定位，将CAR-T细胞直接注入肿瘤组织的内部，从而直接在实体瘤局部发挥免疫治疗的作用。

早期的CAR-T细胞都是由来自肿瘤患者自身的T细胞制备，但是，由于化疗及病情进展等原因，获得足量的患者自身健康T细胞并不容易，而且由于制备CAR-T细胞耗时较多，患者的病情往往等不及应用。因此，制备和储存来源于健康志愿者的异体CAR-T细胞，制成像药物一样随时可用（onshelf）的产品，是CAR-T细胞研发的一大热点。目前，人们已经可以通过crispr/cas9技术对异体T细胞原有的TCR基因进行编辑和删除，从而避免异体T细胞输注引起的移植物抗宿主病（GVHD），使异体CAR-T细胞疗法日趋接近成熟。

基因转染技术的发展是推动和制约CAR-T细胞技术发展和应用的重要因素。增加载体的基因片段容量和转染表达效率，既是相互制约的矛盾（因为外源基因片段越大，转染表达效率越低），也是载体发展必须前进的方向。同时，CAR-T细胞的常用病毒载体均来自HIV的近亲逆转录病毒和慢病毒，虽然现有的技术已经能够切除野生病毒原有的致病基因，但随着接受CAR-T细胞治疗患者生存期的延长，其潜在的风险，依然引起很多人的关注和警惕。因此，发展电转等无病毒体系制备CAR-T细胞的技术与设备，也是临床大规模应用CAR-T细胞治疗的一个发展方向。

当然，CAR-T细胞疗法的应用和推广，离不开对靶标抗原的开发与精准识别。与其他的肿瘤治疗方法一样，CAR-T细胞治疗也存在着耐药的问题。据报道，利用识别CD19的CAR-T细胞治疗1年后，大约2/3的患者会出现肿瘤细胞CD19分子表达的缺失而耐药复发。对这类耐药现象，必须应用靶向其他肿瘤抗原分子（例如CD20等）的CAR-T细胞或者CD19/CD20的双特异性CAR-T细胞等。因此，CAR-T细胞的应用必须建立在足够大的肿瘤抗原库研究的基础上。而解决CAR-T细胞治疗脱靶的问题，减少其对正常组织细胞的损伤（例如CD19靶向 CAR-T细胞引起的 B 细胞缺乏［14］），也必须建立在肿瘤抗原表达精细化研究的基础上。

此外，CAR-T细胞只能识别肿瘤细胞表面表达的抗原，而无法识别其细胞内部表达的肿瘤抗原（例如MAGE-A等癌睾丸抗原）信号，此时就需要联合应用转TCR-T细胞——另一种可识别胞内抗原信号的基因工程化T细胞，从而通过基因工程化T细胞免疫治疗的“双剑合璧”，彻底清除肿瘤细胞。

4 CAR-T细胞的未来与展望

CAR-T细胞是本世纪初免疫治疗领域最为重要的进展之一［15］，也将可能成为21世纪人类最终战胜肿瘤等致命疾病最为重要的免疫学技术。CAR-T细胞如同T细胞一样，直径只有6～18 μm，从尺度上看，称其为一种微米“机器人”细胞是十分恰当的。通过不断地研制和开发CAR，提高其精准度和有效性，该细胞机器人完全可以成为能够精准清除体内致命细胞克隆的显微“手术刀”，不仅能用于治疗恶性肿瘤、自身免疫病和GVHD等免疫相关疾病，还可以用于治疗基因缺陷或者病毒感染细胞导致的遗传及感染性疾病，为人类战胜疾病和延长寿命，提供更加有效的健康保障。