解脂耶氏酵母在食品工业中的应用

王晖，薛庆节，杨媛媛，李秀真，李运清

(济宁医学院 基础医学院，山东 济宁，272067)

解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)是一种非常规酵母，属于半子囊菌类(Hemiascomycetes)。该酵母的抗逆性较强，可耐受高盐、低温以及过高的酸碱环境，因此在自然界中分布广泛，可以从海边、油田等极端环境中分离得到[1]。解脂耶氏酵母有很强的分解疏水化合物的能力，但其可利用的糖类、醇类、糖醇以及有机酸非常少，只能利用葡萄糖、甘油、醋酸盐以及乙酰氨基葡萄糖苷为碳源进行生长[2]。与传统的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)相比，解脂耶氏酵母有很多独特的理化性质、代谢特点以及基因结构，引起了研究人员的兴趣，并对其开展了大量的研究[3]。主要集中在以下几个方面：细胞的二型性、线粒体复合物I、过氧化物酶体、脂类的堆积，脂肪酶的产生，分子生物学工具，生物转化疏水脂肪酸、异源表达和分泌蛋白质、合成有机酸，治理环境及工业中的污染等[4-5]。

能够应用于食品工业中的微生物必须为非致病菌并且被广泛认为是安全的(generally regarded as safe，GRAS)，解脂耶氏酵母被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)认定为此类微生物，广泛应用于食品工业。该酵母之所以被认为是安全的有以下原因：(1)它可以从奶酪、肉以及禽肉中分离得到；(2)酵母菌体可以作为安全营养供给；(3)它可以作为食品以及饲料来使用；(4)可以用来生产不同的食品添加剂[6-7]。本文对解脂耶氏酵母在食品工业中应用的研究进展进行了总结。

1 解脂耶氏酵母在肉类和奶制品的应用

干香肠的味道主要来自于盐、在发酵过程中产生的酸以及代谢糖、蛋白质、脂类过程中所产生的小分子化合物，而酵母菌在这个过程中发挥的作用是不容忽视的。例如PATRIGNANI等人发现，在食品发酵过程中酵母菌可快速降低有效水分的含量，而水分含量的快速降低会减少食品微观结构以及组分的改变程度，保持食品的最佳口感和营养[8]。不同酵母产生的不同脂肪酶和蛋白酶的活性对食品的感官、风味和香气的影响都比较大，因此在香肠的生产过程中采用新的微生物发酵剂对食品的质量、口感、色泽以及营养都是至关重要的。解脂耶氏酵母有很强的蛋白质水解能力和脂肪分解能力，这就为该酵母应用于干香肠的生产过程奠定了基础。有研究表明，解脂耶氏酵母分解蛋白质分泌产生大量的胞外游离脂肪酸如：油酸、亚油酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、二十二烷酸等，这些游离的脂肪酸将在很大程度上提升干香肠的风味。与其他酵母相比，解脂耶氏酵母的抗逆性更强，它可以耐受低温、高渗透压，因此该酵母可在干香肠的发酵过程中生长良好，发挥很好的发酵功能[9]。

奶酪的香味主要由各种挥发性化合物组成，这些化合物是各种微生物在分解凝乳中的糖类、脂类以及蛋白质的过程中产生，因此微生物的种类不同则造成奶酪的风味不同。解脂耶氏酵母中含有的大量脂肪酶和酯酶，因此被认为是在奶酪成熟过程中发挥重要作用的分解脂肪的菌株之一。解脂耶氏酵母以凝乳为底物进行发酵可以产生高品质的富含游离脂肪酸(丙酸、丁酸、亚油酸甘油三酯等)的奶酪，这不仅提高了奶酪的品质，更提高了奶酪的口感和风味。例如在解脂耶氏酵母的参与下可以将三丁酸甘油酯转化为丁酸，而这一特点使奶酪具有特殊的香气，由此做成的切达干酪及卡门培尔乳酪深受广大消费者的喜爱[10]。HÉBERT等人通过转录组、代谢物分析以及VSC分析法研究了解脂耶氏酵母对硫化物的代谢过程。结果表明，解脂耶氏酵母携带有可以合成挥发性硫化合物的基因，而该挥发性硫化合物的产生增加了奶酪的芳香味，从而进一步改善奶酪的口感和风味[11]。

2 解脂耶氏酵母生产γ-癸内酯

γ-癸内酯(γ-Decalactone, GDL)存在于多种水果及乳制品中，具有浓郁的桃香和椰子香，是国际认可的安全的食品添加剂和药品添加剂，广泛应用于食品、香料等行业。目前主要采用发酵法来生产天然的γ-癸内酯，在发酵菌种的选择上解脂耶氏酵母有其独特的优势[12]。解脂耶氏酵母主要以蓖麻油酸为底物，蓖麻油酸在酵母细胞的氧化物酶体中降解，通过4步β-氧化合成GDL的直接前体4-羟基癸酸，然后4-羟基癸酸经过脱水、环化最终生成γ-癸内酯。在降解过程中首先由乙酰辅酶A氧化酶催化进行第一步的β-氧化，在这个过程中有6种不同的酰基-CoA氧化酶(Aox1p-AoX6p)参与，这6种酶各有其不同的特点，分别由POX1-POX6六个基因编码。其中Aox1p、Aox6p参与二元酸的降解，Aox2p有较强的酶活性，主要作用于长链脂肪酸，Aox3p则作用于短链脂肪酸，除参与β-氧化外也可参与到GDL的降解过程，降低GDL产量，Aox4p和Aox5p作用有限。因此研究者试图通过改造菌株来增加γ-癸内酯的产量，研究发现在提高Aox2p的活性的同时降低Aox3p活性可以有效增加GDL的产量[13]。

除了改造菌株以外，优化生产过程的参数也可以提高GDL的产量。有研究表明，在相同的底物浓度下，以传统的发酵模式进行生产可以得到GDL的产量为168 mg/(L·h)，而采用最新的馈料式发酵的产量为220 mg/(L·h)[14]。另一方面通过细胞固定化也可以提高GDL的产量。将细胞固定在多聚物DuoUM上，经过264 h的发酵可以得到1597±34 mg/L的产物，摩尔转化率为29%。而不固定的游离细胞在发酵120 h后得到的产物质量浓度为(954±7) mg/L。细胞固定化不仅可以延长细菌的发酵时间，也可以有效防止已经产生的γ-癸内酯被细胞再次消耗，从而提高产量[15]。在微生物生产过程中，高密度的微生物数量需要足够的氧气才能进行正常的新陈代谢，因此传氧速率同样会影响细胞发酵产生GDL的过程。在生产过程中，主要通过增加通气速率、提高搅拌速率来提高发酵液的体积传质系数Kla，从而进一步提高传氧速率。GOMES等人发现Kla值与GDL的产量有直接相关性的，在搅拌速率和通气速率分别保持在400 r/min和0.6 vvm时，Kla值为70/h，此时GDL产量达到最大为(141±21) mg/L。在该条件下，菌株的生长较快，但γ-癸内酯的得率并不高，这是由于在氧气较充足的情况下有部分γ-癸内酯转化为其他产品，因此该工艺还有待进一步提高[16]。

3 解脂耶氏酵母引起的食品腐败及其控制

人们经常从变色和腐败的禽肉相关食品中分离得到多种酵母，这些酵母与食品颜色和品质的改变有直接关系，解脂耶氏酵母由于其耐酸、耐低温、产气的特性而成为其中的主要微生物。有研究表明，解脂耶氏酵母在5 ℃冷藏的食品的腐败过程中起到重要作用，并且属于禽肉中的优势腐败菌。吴海虹等人在涨袋的泡椒凤爪中分离得到解脂耶氏酵母，并认为该酵母也属于泡椒凤爪的优势腐败菌。由于其耐酸，产气，故在大量繁殖过程中造成食品的涨袋[17]。因此人们越来越重视解脂耶氏酵母在食品中的安全控制问题。

研究表明在低温储存易被解脂耶氏酵母污染的食品时加入2%的乳酸或在4%膝草等植物煮出来的汁中浸泡可有效抑制该酵母的生长，这些植物中的某些成分能有效延长解脂耶氏酵母生长的迟缓期，从而降低生长速率，减少污染[18]。而采用这些植物制作出的精油，如百里香精油、马郁兰精油、牛至精油同样可以抑制解脂耶氏酵母的生长，因此可以作为食品添加剂使用从而降低食品的腐败率[19]。在食品中加入月桂酰葡萄糖可以破坏该酵母形成生物膜，抑制生长。纳塔尔链霉菌产生的纳塔霉素是一种天然抗真菌多烯类化合物，已被用于加入到奶制品中抑制酵母和真菌的污染，在其质量浓度为50 mg/L时可以有效抑制解脂耶氏酵母的生长[20]。综上，解脂耶氏酵母虽然与各种污染的食品都有关系，但通过添加一些物质可以有效地抑制其生长，因此该酵母在食品工业中的应用前景是非常广泛的。

4 解脂耶氏酵母用于有机酸的合成

解脂耶氏酵母在富含碳源的培养基中可以产生大量的有机酸，如柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸(α-KGA)、丙酮酸、琥珀酸等，这些有机酸在食品行业中的应用非常广泛。

长期以来，柠檬酸作为食品、药品添加剂被广泛应用于食品药品行业。早在20世纪80年代，人们就发现解脂耶氏酵母是生产柠檬酸优势菌株之一。由于该酵母可以利用的底物范围非常广泛，因此可以采用工业及农业中的一些生产废弃物来作为底物发酵生产柠檬酸，一方面降低成本，另一方面节约资源、变废为宝，解决环境污染问题。目前人们主要通过分子生物学手段改造菌株、改变发酵底物、改进工艺参数等方法来提高柠檬酸的产量[21]。

在19世纪70年代，人们开始使用解脂耶氏酵母生产α-KGA。人们发现能合成α-KGA的酵母菌株不能合成维生素B1中的嘧啶环，因此在VB1缺乏的条件下，酵母不能生长，但此时可以氧化底物产生大量的α-KGA。最近的一次研究发现菌株VKM Y-2412在最佳培养条件下生产的α-KGA的量可以达到49 g/L。当以乙醇为底物，在锌离子和铁离子存在时，保持高通气率、pH=3.5时可以得到更高的获得率，达到72 g/L。KAMZOLOVA等人以菜籽油为底物生产α-KGA，当满足以下发酵条件：硫胺素密度0.063 μg/g(cells)，pH=3.5，温度30 ℃，通氧率50%，底物质量浓度20～60 g/L，α-KGA的产量为102.5 g/L。除了改变发酵底物，改良发酵工艺外，也有研究人员通过改造菌株，使用工程菌来提高α-KGA的产量[22-23]。YIN等人使用1株VB1合成突变菌株来生产α-KGA，虽然提高了产量，但得到的产品中含有大量的丙酮酸，限制了其在工业生产中的应用[24]。为了进一步提高α-KGA的产量，降低丙酮酸的含量，有研究者将酿酒酵母和米根霉中的丙酮酸羧化酶基因在解脂耶氏酵母WSH-Z06菌株中过量表达构成重组菌株Y.lipolytica-ScPYC1以及Y.lipolytica-SpPYC2。在摇瓶培养时，α-KGA的产量分别提高了24.5%和35.3%，而丙酮酸的含量则分别降低51.9%和69.8%，进一步优化培养条件，α-KGA的最大得率为62.5 g/L，较最原始的报道提高了28%[25]。

工业中也经常使用解脂耶氏酵母为发酵菌株，通过两步法生产琥珀酸(通过氧化α-KGA)。首先以乙醇为底物合成中间产物α-KGA，然后用过氧化氢氧化产生琥珀酸。采用该方法生产的琥珀酸的最高产量为63.4 g/L，并且纯度较高[26]。另外也有研究者试图通过改造菌株来直接生产琥珀酸，例如YUZBASHEV等人通过敲除琥珀酸脱氢酶亚基而直接获得琥珀酸，在摇瓶中培养时琥珀酸的最高产量达到45 g/L。该方法可通过发酵微生物直接获得琥珀酸，免除了两步法中的复杂操作，但由于菌株生长条件要求较高，因此其在工业生产中的应用有待进一步的开发[27]。

5 解脂耶氏酵母生产糖醇

糖醇是相应的单糖经催化氢化及硼氢化钠还原为相应的多元醇。糖醇虽然不是糖但具有某些糖的属性。目前开发的主有山梨糖醇、木糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇、乳糖醇等，这些糖醇对酸、热有较高的稳定性，不容易发生非酶褐变反应 ，成为低热值食品甜味剂，广泛应用于低热值食品配方。国外已把糖醇作为食糖替代品，广泛应用于食品工业中[28]。赤癣糖醇是FDA批准的在全世界广泛使用的食品添加剂，主要作用是替代蔗糖使用[29]。解脂耶氏酵母因其独特的优势目前也被广泛应用于生产赤癣糖醇[30]。

解脂耶氏酵母既可以发酵底物直接生产赤癣糖醇也可以在生产柠檬酸的过程中以次要产品的形式获得赤癣糖醇。解脂耶氏酵母生产赤癣糖醇可用的底物非常多，如葡萄糖、果糖以及甘油等[31]。日本的三菱公司最早以甘油为底物生产赤癣糖醇，但发现对甘油的利用率并不高。当甘油浓度为200 g/L时，采用菌株ATCC 8661摇瓶培养得到的产物浓度为43.2 g/L[32]。为了进一步提高甘油利用率，人们进一步优化发酵条件，并寻找高产菌株。研究发现在低pH值(pH=3.0)时解脂耶氏酵母产生的赤癣糖醇浓度较高，而在高pH值下产量降低。在适宜的pH值下，甘油质量浓度为300 g/L，菌株WratiaslaviaK1生产的赤癣糖醇的质量浓度为170 g/L，比以葡萄糖为底物时的产量提高了6倍[33]。也有研究者分别以高纯度甘油的和粗甘油为底物生产赤癣糖醇，结果表明以高纯度甘油为底物时，赤癣糖醇的产量较高[34]。

在缺乏VB1的培养基中培养解脂耶氏酵母时，赤癣糖醇的产量降低，而高NaCl(浓度为2.5%)可以提高其产量[35]。另外，解脂耶氏酵母也被广泛应用于生产甘露醇，这表明解脂耶氏酵母有生产不同的食品添加剂的潜能。

6 解脂耶氏酵母用于合成单细胞油脂

单细胞油脂(single cell oil，SCO)又称微生物油脂(microbial oils)，是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源、辅以无机盐生产的油脂和另一些有商业价值脂质[36]。单细胞油脂的成分与人们从动物和植物中提取的油脂的成分基本是一致的，并且含有更多的人体必需的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFA)。解脂耶氏酵母是一类产油微生物，即可以在体内堆积大量的油脂，因此被用来生产单细胞油脂[37]。由于其优秀的表现，该酵母目前已被认为是生产生物油的模式生物，对其研究热点主要集中在发酵底物的选择，重组菌株的构造以及作为膳食补充剂的应用。

解脂耶氏酵母可以利用多种底物来生产SCO，尤其是一些廉价、低成本的物质，如工业废水、甘蔗渣、挥发性的脂肪酸等[38]。以葡萄糖为底物生产生物油，当葡萄糖质量浓度为40 g/L时，得到的生物量为31 g/L，油脂含量为12.4 g/L(约占总生物量的40%)[39]。其他的一些挥发性酸，如丁酸、丙酸以及它们的混合物也可以被用于生产SCO，该方法得到脂质在成分上与植物油相同。另外一些酵母菌株也可以使用地沟油或者废机油为底物来生产生物油。如来自海洋的菌株NCIM3589以0.43 g/g地沟油为底物时产生的生物油质量浓度为100 g/L。其中饱和和单不饱和脂肪酸的含量与传统的植物油相同[40]。

一些廉价的可再生原料如棕榈油厂的废水、血清乳胶以及粗甘油也可以作为底物生产生物油。以粗甘油和废水联合作为底物生产生物油，发酵后生物量达到3.21 g/L，油脂含量达到2.21 g/L(占总生物量的68%)，当生产条件进一步改善时可以得到的生物量和油脂含量分别为5.53 g/L和2.81 g/L[41-42]。农业垃圾也可用于生物油的生产，有研究者采用甘蔗渣来培养解脂耶氏酵母酵母菌株PO1g来生产微生物油脂。甘蔗渣被水解后的含糖量为21.38 g/L，加入Ca(OH)2去毒后可用于解脂耶氏酵母的培养。以蛋白胨为氮源可使生物量达到11.42 g/L，其中油脂含量，油脂产量以及油脂的生产能力分别为58.5%，6.68 g/L以及1.76 g/(L·d)[43]。另外脱脂米糠、玉米胚芽蛋白水解物、麦秸水解物都可以作为解脂耶氏酵母的底物来生产生物油脂。

有研究者通过改造菌株，使用工程菌来提高解脂耶氏酵母的生物油脂产量。TAI等人将参与合成甘油三酯的最后一步的酶的基因DGA1过量表达，可以使生物燃油的产量提高4倍。乙酰辅酶a羧化酶催化脂肪酸合成的第一步，将其编码基因ACC1进行过量表达，使油脂产量提高了2倍。当将这两个基因共同过量表达时，使油脂产量提高5倍，使用该重组菌株在培养120 h后油脂含量为61.7%。另外敲除葡萄糖抑制通路的关键基因MIG1、异源表达马克斯克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)的基因INU1均可以提高酵母的产油量[44]。

解脂耶氏酵母也可以用于生产膳食补充剂，因其含有丰富的二十二烷六烯酸、花生四烯酸以及γ-亚麻酸，也可以作为模式生物来生产一些特定的脂肪。例如由于解脂耶氏酵母产生的油脂中总硬脂酸的含量较高，因此可以用于生产代可可脂。综上，解脂耶氏酵母生产生物油脂的过程中，不仅产生的油脂种类较丰富，可利用的底物范围也非常广泛，尤其是一些廉价低成本物质以及废弃物，这不仅节约了成本，也避免了废弃物对环境的污染。

7 解脂耶氏酵母合成单细胞蛋白

单细胞蛋白是一类凝缩的蛋白类产品，含粗蛋白50%～85%，其中氨基酸组分齐全，可利用率高，还含维生素、无机盐、脂肪和糖类等，其营养价值优于鱼粉和大豆粉。长期以来，人们采用解脂耶氏酵母来生产单细胞蛋白。人们发现采用甘油废料做底物可以生产单细胞蛋白，并且生产出来的产品中赖氨酸、丝氨酸以及脯氨酸的含量远远高于蛋蛋白。并且单细胞蛋白营养丰富、并且能增强机体的免疫能力，可作为牲畜、家禽和鱼类等的极其优良的菌类蛋白饲料[45]。

在另一项研究中，解脂耶氏酵母被用于生产抗菌肽，通过发酵得到的蛋白含量为45%～49%。为了进一步扩大可用底物的范围，将外源的马克斯克鲁维酵母的菊糖酶基因在解脂耶氏酵母中表达，所得到的重组菌在含有菊糖的培养基上生长，产生的蛋白的量为47.5%。解脂耶氏酵母菌体也被加入的鱼的饲料中，作为花生烯酸的来源补充，人们发现在饲料中加入20%酵母时，鲑鱼的生长速度最快[46]。

8 小结

解脂耶氏酵母因其独特的生理特性和酶系统为食品工业做出了许多贡献。全球有很多实验室都在研究该酵母在食品工业中的应用，它对肉类制品和乳制品的贡献是非常巨大的。除了直接参与食品的发酵风味之外，它还广泛应用于制备芳香族化合物如γ-癸内酯。有机酸以及在食品工业中有巨大应用的多元醇也可以使用该酵母进行生产。另外这种GRAS生物富含高不饱和脂肪酸和蛋白质，允许其作为食品并以SCO和SCP的形式进食，广泛应用于饲料行业。此外这种酵母产生的多种多样的表面活性剂以及乳化剂也可应用于食品行业。食品工业生产中产生的很多废弃物也可以被解脂耶氏酵母用作底物来生产多种产品。因此，解脂耶氏酵母已逐渐演变为一个高效的微生物工厂，并不断扩大其在食品工业中扮演的不同角色。更多的应用有待我们进一步的研究发现。