真菌毒素暴露对组蛋白修饰影响的研究进展

李晓红，罗红霞，句荣辉，刘小飞，田文静，谌小立，施鹏飞

1(北京农业职业学院，北京，102442) 2(遵义医学院 公共卫生学院，贵州 遵义，563000) 3(北京市昌平区种子管理站，北京，102200)

霉菌毒素是由青霉菌、曲霉菌、镰刀菌和链格孢菌等真菌产生的次生代谢产物[1]。它们广泛分布于各种食物中，已经日益成为威胁人类健康的重大问题之一。其中，黄曲霉毒素(AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、赭曲霉毒素(OTA)、伏马菌素B1(FB1)和T2毒素是被广泛研究的主要污染物[2]，具有肾毒性、肝毒性、致癌性、致突变性、致畸和免疫抑制等毒性。

过去几十年来，对真菌毒素致毒分子机制的研究主要集中在氧化应激、细胞自噬、DNA加合物的形成和关键基因mRNA、蛋白质的改变等方面。随着表观遗传学检测技术的发展，近年来越来越多的研究表明，真菌毒素暴露除了诱导基因序列等遗传学改变外，还会改变基因组的表观修饰状态[3-7]。

已有研究表明，“表观记忆”可作为毒物暴露前期的标志。通常环境毒物会先改变生物体的表观基因组，表观遗传的改变决定了随后的遗传改变[8]。组蛋白的翻译后修饰可改变 DNA 与核蛋白之间的相互作用。这些修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化、瓜氨酸化和ADP-核糖基化。组蛋白修饰作用于多种生物学过程，如基因调控，DNA修复，染色体凝聚(有丝分裂)和精子形成(减数分裂)[9]。所以研究这些真菌毒素对组蛋白修饰的影响，将有助于解释其致毒机制，为真菌毒素毒性的风险评估与预防提供科学的理论基础。

1 真菌毒素对组蛋白赖氨酸甲基化的影响

组蛋白的甲基化通常发生于赖氨酸lysine (K)和精氨酸arginine(R)残基上。组蛋白H3赖氨酸的第4、9、27、36、79位残基(H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79)以及组蛋白H4的第20位赖氨酸残基(H4K20)均可被甲基化。赖氨酸残基上可发生单甲基化(me1)、二甲基化(me2)、三甲基化(me3)修饰(其中精氨酸甲基化有一甲基化, 对称二甲基化和非对称二甲基化 3 种修饰形式)。H3K9、H3K27和H4K20的甲基化通常集中于异染色质区域，与转录抑制及染色质的凝聚状态有关；H3K4和H3K36甲基化与转录激活及染色质的开放结构有关[10-11]。H3K4me2在早期发育中是至关重要的调控因子，是转录激活的标志。已有研究表明，在H3K4me2敲除小鼠中，生殖细胞在卵子发生期间不会经历DNA从头甲基化[12]。H3K9me3及其甲基转移酶参与转录沉默，与卵母细胞发育能力有关[13]。H3K27me3在胚胎干细胞分化过程中抑制关键发育基因的表达上起着重要的作用[14]。组蛋白的甲基化是由组蛋白甲基转移酶催化完成的。可以催化H3K9发生甲基化的酶主要有：Suv39h1，Suv39h2， G9a，ESET/SETDB1和Eu-HMTase1；催化H3K4发生甲基化的酶主要为 MLL(Mixed lineage leukemia)家族蛋白，包括MLL1、MLL2、MLL3、MLL4、SET1A、SET1B以及ASH1；催化H3K27发生甲基化的酶为EZH2；催化H3K36发生甲基化的酶有：SET2，NSD1，SYMD2；催化的H3K79甲基化酶是DOT1。催化H4K20甲基化的酶主要有：Pr-SET7/8，SUV4-20H1和SUV4-20H2。

黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种二呋喃香豆素霉菌毒素，为I类致癌物。此毒素在自然界中含量丰富，人体不能完全通过代谢过程来解毒，并且可能蓄积在体内。食物链中具有强致癌性和肝毒性的AFB1的暴露是世界范围内肝细胞癌发展的一个重要因素[15]。有研究报道，AFB1可影响表观遗传修饰[16]。AFB1喂养的小鼠的卵母细胞中，H3K9me3和H4K20me3(转录激活标记)的水平增加，而H3K27me3和H4K20me2水平(分别为转录抑制和激活的标记)降低。这些改变伴随着整体基因组DNA甲基化水平的升高而发生，并与AFB1暴露的小鼠卵母细胞发育能力下降有关[17]。同样在体外实验中，AFB1引起猪卵母细胞H3K27me3(转录抑制标记)和H3K4me2(转录激活因子)的水平下降，而转录抑制标记H3K9me3的水平升高[18]。AFB1可能是通过改变组蛋白赖氨酸甲基化修饰而影响了卵母细胞的成熟。

伏马毒素是一种由普遍存在的镰刀菌属霉菌产生的水溶性次级代谢产物，是玉米中常见的真菌污染物[19]。其中以伏马毒素B1(FB1)的毒性最强，污染范围最大，从而引起广泛关注。FB1对动物和人类的肝脏和肾脏有致癌性。已有研究表明[20]，FB1能破坏HepG2细胞中的DNA甲基化和染色质修饰。SANCAK等[21]发现,在FB1处理的NRK-52E细胞中整体组蛋白H3K9me2/me3水平升高，H4K20me3水平降低。由此推测整体组蛋白甲基化修饰的改变可能在FB1的致癌性机制中起重要作用。

T-2毒素是由镰刀菌(Fusarium)产生的单端孢霉烯族毒素中毒性最强、污染水平较高的A型霉菌毒素，主要污染小麦、玉米、大麦、燕麦和黑麦等粮食作物及麦芽、啤酒和面包等农产品[22]。T-2具有多种毒性作用，分为基因毒性、细胞毒性、免疫毒性3个方面，主要危害消化系统、神经系统、生殖系统，可造成皮肤、肝脏损伤，生产性能降低等[23]。HT-2毒素是T-2毒素的主要代谢产物。T-2毒素和HT-2毒素可通过污染饲料对动物和动物性食品消费者的健康产生危害作用。ZHANG等[7]研究表明，HT-2会阻碍猪卵母细胞成熟并且影响猪胚胎的发育。在HT-2毒素处理组中，2细胞、4细胞和囊胚期胚胎的百分比均显著低于对照组。荧光强度分析显示猪卵母细胞接触HT-2毒素后，其5-methyl cyososine(5 mC)水平升高，说明HT-2毒素引起猪卵母细胞的DNA甲基化水平增高。HT-2处理组的卵母细胞中H3K4me2和H3K9me2水平升高表明组蛋白修饰也受到影响。研究结果显示HT-2毒素通过改变卵母细胞的表观遗传修饰降低了猪胚胎的发育能力。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，也称为呕吐毒素，是分布最广泛的单端孢霉烯毒素，主要由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌于田间产生，并且在储存期间可能对粮食产生二次污染[24]。它通常污染主食，如玉米、小麦、燕麦和大麦，并对人类和动物产生一系列复杂的毒性作用，例如胃肠疾病、呕吐、腹泻、厌食、生长障碍和免疫功能障碍[25]。也有越来越多的文献显示，DON可诱导促炎基因表达增加，抑制蛋白质合成并破坏线粒体功能，影响膜完整性以及细胞凋亡[26-28]。HAN等[4]以猪卵母细胞为实验模型，研究了脱氧雪腐镰刀菌烯醇暴露诱导猪卵母细胞成熟过程中自噬/凋亡和表观遗传修饰的变化。研究结果表明，DON显著抑制猪卵母细胞成熟，并通过降低p-MAPK蛋白水平破坏减数分裂的纺锤体，导致细胞周期阻滞。此外，在DON暴露下，LC3蛋白表达上调，Lamp2，LC3和mTOR mRNA水平异常，结合膜联蛋白V-FITC染色分析结果表明DON诱导了猪卵母细胞自噬/凋亡。另外，DON通过改变DNMT3A mRNA水平增加了猪卵母细胞中的DNA甲基化水平。DON引起H3K4me2 和H3K27me3蛋白水平升高，而对H3K4me2的甲基转移酶ASH1L的mRNA表达水平在DON处理后无显著变化。DON引起H3K27me3的甲基转移酶EZH2和H3K9me3的甲基转移酶SETDB1、SUV39H2表达量上调，而对SUZ12 和 EED的mRNA表达量无显著影响。因此，由DON引起的H3K9me3甲基转移酶mRNA改变是其抑制卵母细胞发育能力的可能原因。

2 毒素对组蛋白精氨酸甲基化的影响

蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)是主要的II型甲基转移酶，主要通过对组蛋白的甲基化修饰来发挥作用，它能对称性地双甲基化组蛋白(对称性甲基化通常在组蛋白上是一个抑制标志)，从而改变靶蛋白质的功能[29]。PRMT5调控多种关键的细胞途径，具有重要的生物学作用，如细胞分化、细胞增殖和凋亡、核糖体的生物合成、高尔基体的组装等；并与某些蛋白质包括染色体修饰酶和特异性的转录因子结合，导致与细胞周期调控、肿瘤细胞侵袭和转移相关的关键基因转录抑制。另外，它在胚胎发育过程中也具有重要作用。在许多类型的癌症和疾病(白血病、淋巴瘤、神经胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌[30-34])中，PRMT5存在过度表达的现象。

GHUFRAN等[35]用一定浓度的AFB1(10 nmol/L, 100 nmol/L, 1 mmol/L)分别处理人胚胎肺上皮细胞系L-132细胞12和24 h，发现PRMT5的mRNA表达量与AFB1处理呈剂量和时间依赖性。同样，AFB1也诱导人永生化角质形成细胞系HaCaT，人肝癌细胞系HepG2和人胚肾细胞HEK293细胞中PRMT5的蛋白表达量也呈剂量依赖性升高，并且整体精氨酸甲基化水平也以类似的方式升高。该研究表明AFB1可能是通过诱导PRMT5的表达而实现对表观遗传过程的调控。

3 毒素对组蛋白乙酰化的影响

组蛋白的乙酰化和去乙酰化修饰与基因转录调控密切相关。组蛋白的乙酰化状态主要由组蛋白乙酰化酶(histone acetylases, HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases, HDACs)调控。HATs可使组蛋白赖氨酸残基乙酰化，带正电荷的组蛋白与带负电荷的DNA链的亲和性降低，利于DNA构象的展开，促进转录因子与 DNA序列结合，从而激活基因转录；HDACs可使组蛋白去乙酰化，带正电的组蛋白与带负电的DNA 紧密结合，阻碍转录因子与 DNA序列结合，从而抑制基因转录[36]。HATs/ HDACs平衡的紊乱与肿瘤的发生密切相关[37]。

赭曲霉毒素A(OTA)是由几种曲霉菌和青霉菌产生的一种次生代谢物[38]。OTA分布于世界各地可污染各种各样的食物，如谷物(大麦、燕麦、黑麦、小麦、玉米)、豆类、葡萄、咖啡、可可和婴儿食品等[39]，威胁着人类的身体健康。大量研究发现OTA暴露可以引起各种毒性效应，如肝毒性、免疫毒性、基因毒性、遗传毒性、致癌性、致畸性、致突变性、发育毒性、睾丸毒性、胚胎毒性、神经毒性，尤其是肾毒性[40]。IARC(国际癌症研究机构)将OTA归为2B类致癌物。

2011年，CZAKAI等[41]研究证实，组蛋白乙酰转移酶参与了赭曲霉毒素(OTA)致毒性和致癌性的调控。他们认为OTA导致了持续有丝分裂的停滞和无核或细胞分裂有丝分裂的退出。此外，有丝分裂染色体的异常凝聚和姐妹染色单体的分离与核心组蛋白的磷酸化和乙酰化水平的改变有关。他们观察到组蛋白H3苏氨酸3的去磷酸化与OTA对Haspin激酶的抑制没有明显的直接关系。OTA通过在有丝分裂期间对组蛋白H3苏氨酸3的磷酸化水平的调节来调控染色体乘客复合物(CPC)在染色体上的募集。同时，OTA显著抑制了细胞核提取物中组蛋白乙酰转移酶(HAT)的活性，并呈浓度依赖性。HAT可以调节组蛋白和非组蛋白赖氨酸残基的乙酰化。这些结果说明OTA可能是HAT的抑制剂。

MARIN[42]等对7 d，21 d和12个月内喂食致癌剂量OTA的雄性F344大鼠的肾脏样品进行了分析，发现OTA增加了非典型PKC的磷酸化。这与MAPK细胞外调节激酶亚型1和2(ERK1/2)及其底物ELK1/2和p90RSK的选择性下游激活相关。还观察到OTA可使组蛋白去乙酰酶(HDAC)活性增强，并且HDAC活性的增强与HDAC3蛋白表达量的增加具有相关性。HDAC诱导的基因沉默先前已被证明在肿瘤发展中发挥作用。此外，PKC和MEK-ERK MAP-激酶途径也已被证明在细胞增殖、细胞存活、抗凋亡活性和肾癌发展中起重要作用。这些发现说明OTA可能是HDAC的激活剂。但是，有关OTA致毒与组蛋白修饰之间关系的报道还很少。因此，仍需进一步从组蛋白修饰层面研究OTA的潜在毒理学作用机制。

FB1对多种动物有毒性作用。由于与神经鞘氨醇具有结构相似性，FB1通过破坏鞘脂类物质的生物合成发挥其毒性作用。在神经鞘脂类的代谢过程中，FB1竞争性地结合神经鞘氨醇N-2酰基转移酶，从而抑制了神经鞘氨醇的生物合成，阻碍了鞘脂类的生物代谢。鞘氨醇的积累具有很高的细胞毒性可影响多种细胞系统。GARDNER等[43]研究表明，LM/Bc小鼠孕期摄入FB1会使胚胎出现脑炎，人类若在怀孕早期摄入受FB1污染的食物则会增加患神经管缺陷(NTDs)的风险。FB1抑制鞘脂生物合成中的神经酰胺合酶，引起二氢鞘氨醇(Sa)和生物活性鞘氨醇-1-磷酸(Sa1P)在血液、细胞和组织中的累积。鞘氨醇激酶(Sphk)磷酸化Sa形成Sa1P。在激活后，Sphk1主要与质膜结合，而Sphk2主要存在于核中。在过度表达Sphk2的细胞中，Sa1P在核内的积累抑制了组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)的活性，从而导致组蛋白赖氨酸残基的乙酰化增加。在这项研究中，FB1导致LM/Bc小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中Sa1P在核提取物中的累积显著多于细胞质提取物。核内Sa1P的增加使组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)活性降低和H2BK12，H3K9，H3K18和H3K23的组蛋白乙酰化增加。用选择性Sphk1抑制剂PF-543或选择性Sphk2抑制剂ABC294640处理LM/Bc MEFs会显著减轻FB1引起的Sa1P累积(尽管Sa1P水平高于基础水平)。并且PF-543和ABC294640的联合处理可以阻断由FB1引起的Sa1P在核内的积累。已知其他HDAC抑制剂会导致NTDs，所以这些结果表明诱导鞘脂代谢紊乱从而引起核内Sa1P的积累、HDAC的抑制和组蛋白的高乙酰化是FB1引起NTD的潜在机制。

研究表明[21]，FB1处理过的NRK-52E细胞中H3K9ac的整体水平降低，且高浓度FB1对H3K9组蛋白甲基转移酶(HMT)和组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性有一定的影响。这说明FB1可能是通过影响组蛋白乙酰化修饰发挥毒性作用。

4 组蛋白研究方法

关于组蛋白修饰的研究方法目前最常用的为染色质免疫共沉淀技术(chromatin Immunoprecipitation，ChIP)。其基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA 复合物，然后通过超声或酶处理将染色质打断为一定长度范围内的片段，然后特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物，对与靶蛋白结合的 DNA片段进行富集。通过对目的片段进行纯化与检测，获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。ChIP与其他方法的结合扩大了其应用范围。染色质免疫共沉淀结合芯片技术(CHIP-chip)是将生物芯片与ChIP相结合，在全基因组或基因组较大区域上高通量分析DNA结合位点或组蛋白修饰的方法。染色质免疫共沉淀结合新一代短序列测序技术(ChIP-seq)是将ChIP与测序技术相结合，在全基因组范围内检测DNA结合蛋白的结合位点和组蛋白修饰等的高通量方法，可以应用到任何基因组序列已知的物种，并能确切得到每一个片段的序列信息[44]。CHIP-chip和ChIP-seq是目前检测组蛋白修饰最常用的方法。

另外，还有多种组蛋白修饰的检测方法，如：多酶酶解和高分辨LTQ/Orbitrap质谱结合的组蛋白酶解肽段鉴定组蛋白翻译后修饰(PTMs)的分布位点的方法[45]；高通量的液相色谱-串联质谱联用鉴定组蛋白修饰位点的方法[46]；超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-ESI-QTof)定量组蛋白翻译后修饰技术[47]；高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱(HPLC-LTQ/Orbitrap Ms)检测组蛋白的修饰方法[48]；免疫组织化学及蛋白免疫印迹Western Blot方法检测组蛋白的乙酰化和甲基化水平[49]；免疫荧光染色法检测组蛋白修饰情况[50]等。

目前，研究毒素对组蛋白修饰影响的文献中所采用的方法有免疫荧光法测H3K27me3、H3K4me2 和H3K9me3的密度；蛋白免疫印迹法测组蛋白赖氨酸残基的甲基化程度和组蛋白修饰酶的表达量；试剂盒吸光值法测定组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶的活性等。但尚未有用ChIP-seq的方法研究毒素诱导的组蛋白修饰与某些特定基因表达之间关系的报道。比如体内实验中，AFB1引起小鼠卵母细胞中H3K9me3、H4K20me3的水平增加及H3K27me3、H4K20me2水平的降低，进而导致哪些基因的表达量因组蛋白修饰的改变而改变。目前尚未有直接的证据阐明AFB1进一步的致癌机制，其他毒素在组蛋白修饰层面的研究亦存在类似的问题。因此，目前毒素在组蛋白修饰方面的发现只是其致毒调控机制的“冰山一角”，尚有很多重要问题亟待探究。

5 小结与展望

综上所述，黄曲霉毒素(AFB1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、赭曲霉毒素(OTA)、伏马毒素(FB1)、T-2毒素、玉米赤霉烯酮(ZEA)等真菌毒素暴露会对组蛋白修饰产生影响。但在整体组蛋白修饰层面，这几种毒素的作用机制不尽相同。AFB1可以诱导PRMT5过度表达，改变组蛋白赖氨酸甲基化修饰；DON通过影响组蛋白赖氨酸甲基化相关的甲基转移酶的表达而改变组蛋白赖氨酸的甲基化修饰状态；OTA可抑制组蛋白乙酰转移酶(HAT)的活性，增强组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)的活性；FB1可抑制HDAC的活性，引起部分组蛋白的高乙酰化；T-2毒素会改变组蛋白赖氨酸的甲基化修饰状态。

虽然各毒素的组蛋白修饰研究中，实验模型、研究对象、暴露时间和暴露浓度及研究结果不尽相同，但这些真菌毒素对组蛋白修饰的状态几乎都有影响，其表观遗传学层面的研究无疑为探究其致毒机制提供了一个新的思路和视角。为了更全面、深入地了解这些真菌毒素在疾病的发生过程的作用和机制，目前仍需开展以下几方面的研究：

1)进行靶位点检测，明确毒素对组蛋白修饰的确切作用位点。目前的研究表明毒素可以干扰组蛋白修饰模式，但是其作用的特定基因靶点是什么，是否具有特异性等问题尚需探索。

2)对多种细胞系和动物进行不同剂量和时间暴露的实验，体内与体外实验相结合以探究毒素暴露与组蛋白修饰的关系。异常的表观遗传事件会引起遗传学的改变，但是遗传改变也会引起表观遗传的变化[51]。组蛋白修饰改变与基因表达变化在毒素致癌过程中是否互为因果关系需进一步明确。

3)组蛋白修饰与其他的表观遗传现象，即DNA甲基化、miRNA及其他非编码RNA在毒素暴露时如何相互调控需要阐明。组蛋白修饰与DNA甲基化有关，而调控非编码RNA表达的基因启动子区也可能受甲基化修饰，而非编码RNA也会靶向甲基化转移酶及组蛋白修饰酶，需要探索这些交互作用在毒素致癌过程中的意义。

4)单细胞测序技术的出现为研究毒素在单细胞水平上的致毒机制的可变性和精确性提供了可能，会进一步推进精确毒理学概念的发展[52]。

5)组蛋白修饰是可逆的。如何运用食品功能性成分或药物进行癌前预防或治疗是一个值得探索的问题。

我们需要运用系统生物学、遗传学、多组学、大数据分析等技术来进一步研究实验现象和组蛋白修饰机制，对于及早预防和治疗毒素暴露所引起的健康问题具有非常重要的意义。

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