芸豆籽粒中胰蛋白酶抑制剂的研究进展

葛平珍,余 莉,王昭礼,吴宪志,何友勋,张时龙

(毕节市农业科学研究所,贵州毕节 551700)

芸豆,学名菜豆(PhaseolusvulgarisLinn.sp),是普通菜豆和多花菜豆的总称,属豆科(Leguminosae)菜豆属(PhaseolusL.)的小宗杂粮作物[1]。我国常年栽培面积约800万亩,总产量约80～90万吨,主要分布在黑、内蒙古、冀、晋、甘、新、川、滇、黔等地。芸豆也是我国重要的出口商品,每年出口50～70万t,占我国粮食出口的10%左右,位居第4位。芸豆籽粒主要由碳水化合物和蛋白质组成,含有少量抗营养因子(如蛋白酶抑制剂、植物凝集素等),Ca、Fe含量分别是鸡肉的7倍和4倍,且黑芸豆和红芸豆中的天然色素含量较高。有实验表明,芸豆蛋白质含量为17.91%～22.03%,脂肪含量为2.56%～8.46%,总糖(可溶性)含量为4.50%～5.42%[2]。

胰蛋白酶抑制剂是由多个氨基酸组成的多肽或小分子蛋白质。胰蛋白酶抑制剂通过削弱或阻断昆虫肠道蛋白质的消化而导致昆虫非正常发育或死亡;胰蛋白酶抑制剂能抑制蛋白酶水解作用,能有效防止肉类产品软化,能抑制乳腺癌细胞MCF7增殖和治疗糖尿病,还有辐射保护、抗炎等作用[3-9]。由于胰蛋白酶抑制剂既是抗营养因子又是生理活性蛋白,且不同品种、病害程度差异及不同的生理状况影响胰蛋白酶抑制剂的亚基结构[10]。因此,国内外学者对其结构、性质、提取纯化工艺及其作用进行了研究,同时部分学者探讨了深加工技术对芸豆胰蛋白酶抑制剂的影响。

本文将介绍芸豆胰蛋白酶抑制剂的结构、提取纯化工艺、功能作用及加工技术对其影响的研究现状,以期为芸豆胰蛋白酶抑制剂的研究提供理论基础及为芸豆加工技术选择提供指导。

1 胰蛋白酶抑制剂的分类

根据蛋白酶抑制剂所作用的靶酶类型不同,可将其分为四类:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂及酸性蛋白酶抑制剂[11]。胰蛋白酶抑制剂主要作用于含丝氨酸的蛋白酶,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂[12]。

豆类中胰蛋白酶抑制剂主要有两类:Kunitz型(KTIs)和Bowman-Birk型(BBIs),其中KTIs剂属于典型丝氨酸蛋白酶抑制剂,由170～200个氨基酸组成,分子量为18～22 kDa,含有高度保守的N端区域,且4个半胱氨酸残基形成2个链内二硫键,此抑制剂只有一个活性中心,主要抑制含丝氨酸的蛋白酶,此抑制剂有调节内源性蛋白酶、抗虫、抗癌、抗炎等作用;BBIs由60～80个氨基酸组成,分子量为8～10 kDa,其中14个半胱氨酸残基形成7个二硫键,此抑制剂含有两个活性中心,分别对胰蛋白酶及其类似物、弹性蛋白酶及其类似物和胰凝乳蛋白酶及其类似物有抑制作用[13-16],此抑制剂有抗癌、抗虫等活性,且可作为选择性辐射保护剂[17]。

棕色芸豆中胰蛋白酶的N端氨基酸序列为SGHRHESTDEPS,与菜豆中双头胰蛋白酶抑制剂的部分氨基酸序列相似,分子量约为17 kDa,推测棕色芸豆中的胰蛋白酶抑制剂为Bowman-Birk型抑制剂[3];红芸豆中胰蛋白酶抑制剂分子量约为18 kDa,对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的抑制活性分别为18.76及12.62 U/mg protein[4];小黑芸豆中胰蛋白酶抑制剂分子量约为24.3 kDa,初步断定其为Kunitz型胰蛋白酶抑制剂[18]。

2 芸豆胰蛋白酶抑制剂的提取、分离及纯化

从芸豆中提取胰蛋白酶抑制剂分为粗提和纯化两部分,但脱脂芸豆浸出液中胰蛋白酶抑制剂的活性较高,因此在粗提前需对芸豆进行脱脂处理。通过优化实验选择合适的提取溶剂(酸、碱、盐、缓冲溶液及去离子水等)和最佳的提取条件(温度、时间和pH),随后通过热变性处理或硫酸铵分级沉淀等方法除去杂蛋白以得到粗提液,再通过凝胶过滤层析、离子交换层析或亲和色谱层析等进行纯化,最后用高效液相色谱法(HPLC)及SDS-PAGE电泳法测定纯化后胰蛋白酶抑制剂的纯度和分子量。不同品种的芸豆籽粒,其含有的胰蛋白酶抑制剂分子量存在差异,国内外学者开展了对不同芸豆品种籽粒胰蛋白酶的提取、分离及纯化的研究。

Sriket等[4]在粗提前用正乙烷脱脂,脱脂干燥后的红芸豆粉用0.15 mol/L的NaCl溶液(1∶10,w/V)室温下振荡提取3 h,经过冷冻干燥、90 ℃加热10 min、冰水冷却,得到分子量为18 kDa的胰蛋白酶抑制剂,能抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。Mittal等[5]以0.1% NaCl(1∶40,w/V)为浸提溶剂,脱脂芸豆粉在60 ℃振荡浸提52 min,冷冻干燥得粗提物;粗提物经20%～70%的硫酸铵沉淀、0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)透析、DEAE-纤维素阴离子交换层析、Sephadex G-100 凝胶柱层析、阳离子交换柱层析、CM-Sephadex C-50 凝胶柱层析等进行纯化,通过高效液相色谱分析及SDS-PAGE分析,得到分子量为15 kDa的胰蛋白酶抑制剂。Chan等[3]以棕色芸豆为研究对象,浸泡过夜后经去离子水浸提,用Tris-HCl缓冲液调节浸提液,上清液经Affi-gel蓝胶亲和层析、Q-Sepharose 和 Mono Q的阴离子交换层析、Superdex 75 凝胶层析进行纯化,通过SDS-PAGE及氨基酸序列分析,得到分子量为17 kDa且N端氨基酸序列为SGHRHESTDEPS的胰蛋白酶抑制剂。刘盈盈[19]以紫花芸豆为材料,经乙醚脱脂、酸抽提、热变性、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析等,得到表观分子量约为59 kDa的胰蛋白酶抑制剂,含有3个亚基(34、16、15 kDa),等电点为pH5.25。Wati等[20]通过热处理(70 ℃,10 min)和硫酸铵沉淀从红芸豆中分离胰蛋白酶抑制剂,经SDS-PAGE分析得到其分子量为118 kDa;其IV组分能抑制罗非鱼肌肉的降解。

3 芸豆胰蛋白酶抑制剂的稳定性

芸豆胰蛋白酶抑制剂的稳定性主要由其特定的亚基决定的,具有良好的热稳定性及pH稳定性,部分金属离子能增强其抑制活性(如Hg2+、Na+、Zn2+及Ca2+等),但有的金属离子却能降低其抑制活性(如Fe3+、Mn2+和Co2+等)。芸豆胰蛋白酶抑制剂的稳定性研究对其应用具有重要意义,现阶段已有学者对不同品种芸豆的胰蛋白酶抑制剂稳定性进行了研究。

Mittal等[5]对芸豆胰蛋白酶抑制剂的稳定性进行研究,发现其在pH为3～11、温度为40～60 ℃均能保持活性,K+、Hg2+、Na+、Zn2+、Ni+、Cd2+及Ca2+等能增强其活性,Fe3+、Mn2+及Co2+等降低其活性,酪蛋白、CaCl2、BSA和蔗糖能增强其稳定性,且是解离常数为1.85 μmol/L的竞争性抑制剂。张伦等[21]发现紫花芸豆胰蛋白酶抑制剂在100 ℃处理60 min活性仅丧失30%,具有良好的热稳定性;同时,刘盈盈等[22]发现还原剂(如DTT)和变性剂(如尿素、盐酸胍等)能改变紫花芸豆胰蛋白酶抑制剂的结构。Chan等[3]发现棕色芸豆胰蛋白酶抑制剂具有良好的热稳定性(90 ℃以下其均有活性)及pH稳定性(pH为0～14其均能保持活性)。俞红恩等[23]在极端环境(酸、碱、盐、热及振荡等)处理芸豆粗提液,其胰蛋白酶抑制剂残余活性、亚基相对含量及亚基数目变化的结果一致,表明胰蛋白酶抑制剂的稳定特性是由具备相应稳定特性的亚基决定的。

4 芸豆胰蛋白酶抑制剂的功能研究

芸豆胰蛋白酶抑制剂是一类抗营养因子,但其也能作为活性蛋白参与生理代谢活动的调控,如抗癌细胞增殖、抗虫及降糖作用等,其应用范围较广且前景良好。

Chan等[3]发现棕色芸豆的胰蛋白酶抑制剂能较好抑制乳腺癌细胞MCF7增殖(IC50为71.52 μmol/L),对肝癌细胞HepG2和胎肝细胞WRL68的增殖也有一定的抑制作用(IC50为110 μmol/L)。Mittal等[5]探讨芸豆胰蛋白酶抑制剂抗虫的作用机理,发现芸豆蛋白酶抑制剂能抑制铃夜蛾属(Helicoverpa)棉铃虫(H.armigera)和斜纹夜蛾属(Spodoptera)斜纹夜蛾(S.litura)肠道类似胰蛋白酶的蛋白酶,其抑制活性分别为59.5%～91.7%及4.7%～29%;芸豆胰蛋白酶抑制剂饲喂棉铃虫及斜纹夜蛾幼虫,将会降低幼虫体重及导致幼虫死亡,致死率分别为46.7%和13.3%,且将延长幼虫的化蛹时间;当用芸豆胰蛋白酶抑制剂饲喂棉铃虫及斜纹夜蛾成虫,其致死率分别为60%及13.3%。芸豆胰蛋白酶抑制剂对鳞翅目昆虫有一定的抑制作用,可将芸豆胰蛋白酶抑制剂的基因转移到其他植物中,提高植物对鳞翅目昆虫的抗性。王静等[6]探讨紫花芸豆胰蛋白酶抑制剂的降糖作用,发现紫花芸豆胰蛋白酶抑制剂能降低四氧嘧啶诱导的血糖升高,且能降低总胆固醇(TC),对治疗糖尿病有一定作用。

5 不同加工方式对芸豆胰蛋白酶抑制剂的影响

芸豆中胰蛋白酶抑制剂一方面限制了芸豆的利用方式,但另一方面又能参与机体生理代谢活性,因此需选择恰当的加工方式降低或去除芸豆胰蛋白酶抑制剂。为了拓展芸豆的利用范围,可采用多种加工处理方法(如浸泡、烹煮、高压灭菌、电离辐射、烹调、烘烤、脱壳、萌芽、发酵、化学物质处理、酶处理及挤压蒸煮等)降低及去除胰蛋白酶抑制剂。这些加工方式主要是增强种皮渗透性,使胰蛋白酶抑制剂迁移到介质中(如浸泡、萌发等),或改变胰蛋白酶抑制剂的结构(如挤压蒸煮等),从而降低或去除芸豆胰蛋白酶抑制剂。

El-Hag等[24]对红芸豆进行萌发处理,发现萌发使红芸豆的胰蛋白酶抑制剂降低了约50%。El-Hady等[25]探讨浸泡后不同挤压条件(滚筒温度、进料水分含量)对芸豆胰蛋白酶抑制剂的影响,发现浸泡后芸豆胰蛋白酶抑制剂活性降低1.5%,挤压后无抑制活性。Wang等[26]研究蒸煮对芸豆胰蛋白酶抑制剂的影响,用去离子水室温下浸泡芸豆24 h(芸豆∶水(w/w)=1∶4),用自动Mattson蒸煮器对芸豆进行蒸煮,发现蒸煮后芸豆胰蛋白酶抑制活性从10.9 mg/g干物质降至1.02 mg/g干物质。Khattab等[27]发现浸泡、热处理(蒸煮、烘烤、微波烹饪及高压灭菌)、发酵、微粉化等都能降低芸豆胰蛋白酶抑制剂含量。Shimelis等[28]探讨浸泡、萌发、蒸煮、高压灭菌及其组合对芸豆抗营养因子的影响,发现蒸煮及高压灭菌能有效降低芸豆中的胰蛋白酶抑制剂含量,浸泡后进行高压灭菌的组合处理效果更佳。

6 总结与展望

中国西北地区和西南地区芸豆种植面积较广,现阶段主要进行粗加工,精深加工产品较少,抗营养因子—胰蛋白酶抑制剂限制了芸豆的利用范围,对芸豆胰蛋白酶抑制剂的性质、分类、提取纯化、功能特性等的研究现状进行概述,将为去除芸豆中抗营养因子——胰蛋白酶抑制剂提供理论基础。全面了解芸豆胰蛋白酶抑制剂从提取、纯化到功能特性的研究近况,充分利用其抗虫、降糖、抑制癌细胞增殖活性,将其运用于生物农药及临床治疗。

学者进行了不同加工技术对芸豆胰蛋白酶抑制剂的影响研究,不仅充分认识这些加工技术是如何影响胰蛋白酶抑制剂含量,还为芸豆前处理加工技术的选择提供理论指导。通过学者研究发现不同加工技术对芸豆胰蛋白酶抑制剂的影响存在轻微差异,但主要通过改变芸豆种皮的通透性及改变芸豆胰蛋白酶抑制剂的结构,从而降低芸豆籽粒中胰蛋白酶抑制剂含量。

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