小黑麦不同品种劣变种子的胚培养效果研究

2018-03-27田新会杜文华

草原与草坪 2018年1期

李雪，田新会，杜文华

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州 730070)

小黑麦(Triticalewittmack)为禾本科一年生草本植物，由小麦(Triticum)和黑麦(Secale)经属间有性杂交和杂种染色体加倍而成的新物种，不仅表现了小麦的丰产性和籽粒的优良品质，又保持了黑麦抗逆性强和赖氨酸含量高的特点，是一种很有前途的粮饲兼用型作物[1-3]。

种子的劣变是指因种子生存能力降低、导致种子丧失生活力和萌发力的不可逆转变化，是伴随着种子贮藏时间延长而发生的、不可避免的过程[4]。在劣变过程中种子内部发生一系列生理生化变化，种子的各种功能和结构受到损害[5-7]，其损害程度随时间延长而逐渐加剧，从而导致种子质量下降，种子活力下降，甚至丧失生活力[8-9]。这主要是因为，虽然胚具有活力，但胚乳丧失了为胚萌发提供营养物质的能力，从而使胚由于缺乏营养而失去活力[10]。

植物胚是一个具有全能性的多细胞结构，通常能够正常发育成熟，而且可以直接播种形成完整植株。通过离体胚培养，使可能败育或退化的胚获得再生植株，在植物育种中具有十分重要的理论与实践意义[11-12]。

胚培养可以追溯到18 世纪，Charles Bonnet分离并培养了菜豆和荞麦的胚并获得了植株[13-14]。较为系统的胚挽救技术开始于20 世纪初，目前胚挽救技术已被广泛地应用于小麦[15]、大麦[16-17]、水稻[18]、茄子[19]、油菜[20]、百合[21]、以及众多果树如桃[22]、葡萄[23-24]、樱桃[25]、苹果[26]、柿[27]、李[28]、柑橘[29-30]等。Sirkka等最早进行小黑麦胚挽救技术研究[31]。目前国内外对小黑麦劣变种子胚挽救技术研究较少。为提高劣变种子的利用率和挽救种质资源，试验以10份澳大利亚小黑麦品种的劣变种子为试材，在体外进行胚培养，以比较各品种的胚发育率、胚萌发率和成苗率，为小黑麦种质资源挽救提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为引自澳大利亚10个小黑麦品种(Cherokee，While M96-3182-1，33rd ITSN，DH265，AT315，Rhino，AT574，AT528，32rd ITSN，2090White)的劣变程度相同的种子。对照为甘肃农业大学草业学院培育的小黑麦新品系C24(CK1)和C31(CK2)，在室温条件下保存一年的种子。

1.2 培养基

1/2MS+2%蔗糖+0.1%麦芽糖+0.5%琼脂， pH 5.8，于121℃高压灭菌20 min。

1.3 种子消毒及接种

先将参试材料的种子冲洗干净，用次氯酸钠消毒5～10 min，再用蒸馏水冲洗干净。将冲洗干净的种子浸泡在蒸馏水中，放置4℃冰箱24 h。

将浸泡的种子在无菌操作台用次氯酸钠消毒5～10 min，无菌水冲洗干净并用无菌滤纸将种子干燥。用镊子将种皮剥除，然后将胚从胚和胚乳连接处切出，完整的胚盾片向上接种到培养基中。

1.4 培养及转接

将接种好的胚放置于17℃、光照16 h、黑暗8 h的培养箱中进行培养。当胚发芽至3片叶时，转移到花盆。

1.5 试验设计

将引自澳大利亚10个劣变小黑麦品种(Cherokee，While M96-3182-1，33rd ITSN，DH265，AT315，Rhino，AT574，AT528，32rd ITSN，2090White)和对照材料经种子消毒及接种后在培养箱中培养，每个处理设3次重复，每天定时进行观察，每隔5 d统计小黑麦的胚发育率、成苗率，直至小黑麦的胚发育率、成苗率不在变化。

1.6 测定指标及方法

接种的胚长出绿芽或须根时为胚发育，胚发育率为发育胚数占接种胚珠数的百分率[32]。

胚发育率(%)=胚发育数/接种胚数×100%

成苗率为正常苗数占接种胚珠数的百分率。正常苗为具有正常的根、茎和叶等器官的植株[32]。

成苗率(%)=成苗数/接种胚数×100%

1.7 数据分析

用SPSS19.0软件中二因素随机区组试验设计的统计方法，分别分析不同小黑麦材料间、培养时间间和品种×培养时间交互作用间胚发育率、胚萌发率和成苗率方差的差异显著性，进行方差分析时将胚发育率和成苗率进行数据转換(反正弦转換)。如果差异显著，用Duncan法进行多重比较。对小黑麦的胚发育率和成苗率进行相关性分析。用Excel进行数据整理和作图。

2 结果与分析

小黑麦材料间，诱导培养天数间以及小黑麦材料间×诱导培养天数交互间的胚发育率和成苗率存在极显著差异(P<0.01)，需进行多重比较(表1)。

2.1 胚发育率

2.1.1 小黑麦材料间胚发育率的差异参试的12份小黑麦材料中，2个对照的胚发育率相近，显著高于其余材料；Cherokee和DH265的胚发育率显著高于其余参试材料；小黑麦材料2090White、AT528、While M96-3182-1、AT574和AT315的胚发育率依次降低，且有显著差异；33rd ITSN和、32rd ITSN和Rhino的胚发育率为0(表2)。

表1 小黑麦胚发育率和出苗率的方差结果分析

注：**达到极显著水平(P<0.01)，下同

表2 小黑麦材料间胚发育率和成苗率的差异

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

2.1.2 培养天数间胚发育率的差异由于小黑麦品种33rd ITSN、32rd ITSN和Rhino的胚发育率为0，所以从培养天数间胚发育率差异的影响中去除。随着培养天数增加，小黑麦胚的发育率逐渐增加(表3)。0～7 d时，小黑麦材料的胚发育率显著低于其他培养天数；7～12 d时，胚发育率增加较快，增加率为25.4%；随着诱导培养时间的继续延长，胚发育率增加幅度减缓，27 d和32 d时，胚发育率无显著差异。

表3 诱导培养天数间胚发育率和成苗率的差异

2.1.3 小黑麦材料×培养天数交互作用间胚发育率的差异 CK1和CK2的胚发育率在诱导培养12 d时已经完全发育，显著高于其余小黑麦材料。随着诱导培养天数增加，各参试小黑麦材料胚发育率的变化有差异，Cherokee诱导培养7 d的胚发育率较低，为57.65%，随着诱导天数增加，胚发育率逐渐增加，27、32 d时胚发育率显著增加；DH265诱导培养7 d的胚发育率较高(83.33%)，胚发育率随着诱导天数的增加而缓慢增加，22 d时胚发育率显著增加，27，32 d时胚发育率还在增加，但无显著差异；2090White诱导培养7 d时，胚发育率较低(31.18%)，12、17、22 d时胚发育率增加速度较快，差异显著(P<0.05)，27、32 d的增加缓慢，无显著差异(P>0.05)；AT528的胚发育率在诱导培养7 d时胚发育率为56.67%，12 d时胚发育率显著增加，诱导培养12、17、22、27 d胚发育率增加缓慢，无显著差异。AT315在诱导培养7 d时，胚发育率较低(5%)，12，17 d胚发育率显著增加，17 d较12 d高118.95%，27，32 d胚发育率显著增加；While M96-3182-1诱导培养7 d时胚发育为11.76%，12、17、22、27 d胚发育率增加，均差异显著，27 d和35 d胚发育率无显著差异。AT574诱导培养7 d时胚发育率为0，诱导培养12 d胚发育率为25.56%，诱导培养17，22和27 d胚发育率显著增加，诱导培养35 d胚发育率增加缓慢，无显著差异(图1)。

图1 小黑麦材料×培养天数交互作用下的胚发育率Fig.1 Triticale materials×days of inducting culture of difference embryo development rate between interaction注：柱形图间不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同

2.2 成苗率

2.2.1 小黑麦材料间成苗率的差异对照材料的成苗率显著(P<0.05)高于其余材料。参试小黑麦材料劣变种子的成苗率为8.23%～57.16%，Cherokee的成苗率最高,为57.16%，显著高于其余参试小黑麦材料；DH265次之，其成苗率显著高于除CK1、CK2和Cherokee之外的其他材料；2090White和AT528的胚成苗率相近，居第3位；其余材料的胚成苗率较低(表2)。

2.2.2 诱导培养天数间成苗率的差异诱导培养7 d时，小黑麦材料的成苗率为0。随着诱导培养天数增加，成苗率逐渐增加，除27 d和32 d间小黑麦材料的成苗率无显著差异外，其余天数间的胚成苗率均有显著差异(P<0.05)。诱导培养17 d时，小黑麦成苗率比12 d高67.18%，22 d的成苗率比17 d高18.90%，27 d的成苗率比22 d高7.65%；诱导培养时间27 d后，随着培养时间延长，成苗率增加缓慢(表3)。

2.2.3 小黑麦材料×培养天数交互作用间成苗率的差异 CK1和CK2在诱导培养12 d时已经全部成苗，其成苗率显著(P<0.05)高于其余小黑麦材料。参试的小黑麦材料在诱导培养7 d时成苗率均为0。Cherokee诱导培养12 d时成苗率较低(6.47%)，诱导培养17 d时成苗率显著增加，但诱导培养22，27和32 d增加缓慢，差异不显著；DH265在诱导培养12 d时成苗率为0，诱导培养17、22 d成苗率显著增加，27、35 d成苗率增加缓慢，无显著差异；2090White的成苗率在诱导培养12，17和22 d成苗率显著增加，27、35 d成苗率增加缓慢，差异不显著；AT528诱导培养12 d的成苗率较高(40.67%)，17 d成苗率显著增加，22，27和35 d的成苗率增加缓慢，差异不显著；AT315在诱导培养12 d时成苗率为0，17、22 d成苗率显著增加，27、35 d成苗率无差异显著性；While M96-3182-1诱导培养12 d时成苗率为6.62%，诱导培养17 d成苗率显著增加，高于241.24%，22 d时成苗率显著增加，27、35 d成苗率增加差异不显著；AT574诱导培养12 d、17 d成苗率为0，诱导培养22，27和35 d成苗率增加，但无差异显著(图2)。

图2 小黑麦材料×培养天数交互作用的成苗率Fig.2 Triticale materials×days of inducting culture of difference seedling rate among interaction

2.3 胚发育率和成苗率的相关性分析

小黑麦材料的胚发育率和成苗率相关性分析(表4)表明，小黑麦的胚发育率和成苗率呈极显著正相关(R=0.97)。

表4 胚发育率和成苗率的相关性分析

2.4 再生苗移栽的幼苗成活率、株高和叶片数

对照CK1和CK2的成活率最高，显著高于其他参试小黑麦材料。劣变的种子胚成活率为9.55%～69.42%，且不同品种差异显著，其中Cherokee成活率最高，其次为DH265，AT315的成活率最低(表5)。

对照CK1和CK2的平均株高最高，显著高于其余参试小黑麦材料。AT528平均株高较高，为16.40 cm，和CK2无显著差异，其次为Cherokee，While和M96-3182-1，AT574的平均株高最低。

小黑麦品种AT528的平均叶片数最高，显著高于其余参试小黑麦材料；其次为CK1、Cherokee和AT315，3品种的平均叶片数无显著差异；AT574的平均叶片数最少，除与2090White无显著差异外，显著低于其余参试小黑麦。

3 讨论

贮藏时间对种子的萌发具有较大的影响。张东晖等[33]研究表明，随贮藏时间延长，种子劣变加剧，但有一定的安全贮藏期。贮藏14年丧失活力，贮藏7～8年失去种用价值，贮藏6年活力骤然下降，不宜作为播种用，贮藏4年保持较高的活力，适当可作播种用，也可作为种质资源保存期延长至6年，贮藏2～3年活力表现最强，说明其种用价值最佳。试验选用不同程度劣变种子进行研究，表明正常的种子胚的发育率和成苗率较高，并且由于劣变种子的劣变程度不同，其发育率和成苗率各异，发育率由高到低依次为：CK2>CK1>DH265>Cherokee>2090White>AT528>WhileM96-3182-1> AT754>AT315，成苗率依次为：CK2>CK1>Cherokee>DH265>2090White>AT528>WhileM96-3182-1> AT754>AT315。从而说明DH265和Cherokee的劣变程度较轻，2090White和AT528居中，其余3个材料种子的劣变程度较重，而33rd ITSN，32rd ITSN和Rhino小黑麦种子已经丧失了活力。和张东晖等[33]的研究结果类似。不同植物种类或品种胚培养存在较大差异。傅雪琳等[34]研究发现，成熟稻材料间胚愈伤组织诱导率、质地结构和绿苗再生率有显著差异。王丹菲等[35]用不同百合品种杂交获得的幼胚为外植体，进行离体胚培养发现，不同杂交组合的胚发育率差异较大。试验材料DH265和Cherokee的劣变程度较轻，但2个材料间的胚发育率和成苗率还有显著差异。由于成苗率和胚发育率极显著正相关，所以对其差异原因没有单独列出。

胚培养时间对胚挽救具有重要作用，张月琴等[36]研究表明，小麦成熟胚培养12 d就可以达到理想的分化效果，唐冬梅等[37]研究表明，无核葡萄不同基因型的胚培养时间不同。试验结果表明，随着诱导天数增加，参试小黑麦材料的胚发育率逐渐增加。诱导培养7～12 d时胚发育率和成苗率增加幅度较大，诱导培养27 d和32 d时小黑麦材料的胚发育率和成苗率无显著差异，说明小黑麦胚培养的适宜诱导培养时间为27 d。

由小黑麦材料×诱导培养天数间的胚发育率和成苗率差异可知，CK1和CK2的胚发育率和成苗率在诱导培养12 d时，均达100%，但劣变小黑麦材料种子在诱导培养27 d时，胚发育率仍没有达到100%，表明种子劣变对胚萌发有很大影响。参试的每种小黑麦材料的胚发育率和成苗率随着时间的增加而增加，但增加的速度不同。材料Cherokee的胚发育率在7～12 d时增加较快，而2090White在17～22 d增加快，AT315和WhileM96-3182-1随着时间的增加呈阶梯式增加，其余材料的胚发育率显著增加，但幅度不大。小黑麦材料2090White和AT528的成苗率在7-12 d时增加幅度较大，Cherokee和DH265在12-17d时增加快，其余材料增加匀速增加。赵占军等[38]研究胚龄对小麦幼胚组织培养效果中表明，幼胚组织培养最适宜的胚龄为14～16 d。孙苏阳等[39]研究表明，小麦胚龄为16 d 时，其萌发率和成苗率较高，是较为合适的幼胚培养时期。材料33rd ITSN，32rd ITSN，Rhino随着诱导培养时间的增加而无变化，可能由于其种子劣变时间较长，而失去活力。

4 结论

小黑麦材料间胚发育率由高到低依次为：CK2>CK1>DH265>Cherokee>2090White>AT528> WhileM96-3182-1>AT754>AT315，成苗率的顺序为：CK2>CK1>Cherokee>DH265>2090White>AT528> WhileM96-3182-1>AT754>AT315；小黑麦品种33rd ITSN、32rd ITSN和Rhino的胚发育率和成苗率均为0，完全失活；对劣变小黑麦的种子没丧失活力的胚进行培养，最适宜的时间为27 d。

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