一种pH响应性纳米粒对牙周菌斑生物膜的抑制作用及生物相容性评价

(青岛大学附属医院牙周病科，山东 青岛 266003)

牙周炎是目前全球范围内最普遍的慢性疾病之一[1-2]。该病人群患病率较高，且往往在晚期才会被诊断出来，因此严重影响患者的生活质量，并给患者增加极大的经济负担。而引起牙周炎的始动因素便是菌斑生物膜(菌膜)[3-4]。菌膜微环境具有独特的特征，其pH值可以达到4.5，甚至更低[5]，此外表面带有大量的负电荷[6]，因此，设计一种靶向性的能够吸附在菌膜表面并且对菌膜的低 pH环境有响应性的纳米粒子，是破坏菌膜、杀死菌膜内菌体的有效方式。季铵盐壳聚糖是壳聚糖的衍生物，因带有永久的正电荷而使其本身具有较高的抑菌活性[7]。脂质体是一种带负电囊泡状结构的生物材料，具有与多种物质结合的能力，被广泛作为药物输送载体[8]。本实验选择治疗牙周病的首选药物盐酸多西环素作为模型药物[9]，以带负电荷脂质体作为药物载体，并以正电性的季铵盐壳聚糖作为纳米粒外壳旨在制备具有pH响应性的季铵盐脂质体多西环素纳米粒(TMC-Lip-DOX NPs)，通过牙周炎的厌氧菌体外抑菌试验测试TMC-Lip-DOX NPs的抑菌活性，通过牙周膜成纤维细胞测试其细胞相融性。从而探讨该具有pH响应性的TMC-Lip-DOX NPs作为口腔临床用药的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料来源

壳聚糖(相对分子质量为150 000，脱乙酰度为85%)及蛋黄卵磷脂购自山东莱州海利生物制品有限公司。碘甲烷(CH3I)、二甲亚砜(DMSO)、氢氧化钠(NaOH)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基、α-MEM培养基和胰蛋白酶均购自青岛云山生物科技有限公司。牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalisATCC33277)、中间普氏菌(P.intermediaATCC25611)和伴放线放线杆菌(A.actinomycetemcomitansY4)由中国海洋大学微生物学实验室提供。牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)由青岛大学细胞实验室提供。噻唑蓝(MTT)和研究中的其他化学试剂购自青岛华盛化学试剂公司。SD大鼠购买自上海斯莱克有限公司。

1.2 pH响应性纳米粒的合成及其表征

1.2.1季铵盐壳聚糖的制备 季铵盐壳聚糖是在碱性的条件下将壳聚糖进行甲基化作用而合成的[10-11]。称取2 g壳聚糖粉末加入到40 mL二甲亚砜和6 mL NaOH(150 g/L)的混合溶液中，在室温条件下搅拌一定的时间，然后加入12 mL的碘甲烷，60 ℃下反应1 h。1 h后，再往烧瓶中加入适量的150 g/L的NaOH和CH3I，使其彻底反应。反应结束后，加入无水乙醇出现白色沉淀后终止反应，透析、冻干。即得水溶性的季铵盐壳聚糖。

1.2.2脂质体的制备 脂质体采用薄膜蒸发法制得[12]。称取质量70 mg的蛋黄卵磷脂，加入体积比为1∶1的三氯甲烷和无水乙醇溶解，在35 ℃减压的条件下蒸发干燥至形成均匀薄膜。加入5 mL pH 7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中溶有25 mg胆酸钠和5 mg多西环素，在55 ℃的水浴中旋转搅拌30 min，冰浴下超声4次后，得到脂质体纳米粒混悬液。而且，水化过后，1 g/L的多西环素被包含在脂质体囊泡中。

1.2.3TMC-Lip-DOX NPs制备 将0.5 g/L的季铵盐壳聚糖溶液缓慢滴加到等体积包载多西环素脂质体乳液中，滴加完成后继续搅拌一定时间，超声后得到TMC-Lip-DOX NPs。

1.2.4TMC-Lip-DOX NPs粒径大小、分布情况和形态检测 使用激光粒度/Zeta电位分析仪分别测定游离脂质体(A组)、pH 7.2环境下的季铵盐脂质体(B组)、pH 4.5环境下的季铵盐脂质体(C组)和pH 7.2环境下的TMC-Lip-DOX NPs(D组)的粒径大小及分布情况，并在透射电子显微镜下观察纳米粒形态。

1.3 菌斑生物膜的形成

将牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和伴放线放线杆菌分别置于TSB液体培养基中培养待用。随后将3种菌液等体积混合后再用培养基将混合后的菌液稀释至1×109CPU/L，并滴加至放有羟基磷灰石片的6孔板内，并于37 ℃严格厌氧环境下培养24 h[13]，羟基磷灰石片上即得混合菌斑生物膜。

1.4 TMC-Lip-DOX NPs对游离混合菌抑菌活性

采用MTT法检测纳米粒对游离混合菌的抑菌活性。将牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和伴放线放线杆菌混合后的菌液稀释至1×108CPU/L。取200 μL稀释后的细菌悬液分别与等体积的培养基溶液(A组)、季铵盐溶液(B组)、多西环素溶液(C组)、季铵盐脂质体溶液(D组)和TMC-Lip-DOX NPs溶液(E组)混合，并分别滴加至96孔板中培养24 h。随后加入含0.5 g/L 的MTT的培养基培养4 h，弃去培养基后加入100 μL的DMSO，10 min后用酶标仪在波长492 nm处测定其吸光度(A)值。以相同方法重复该实验3次。

1.5 TMC-Lip-DOX NPs对菌斑生物膜抑菌效果

待羟基磷灰石片上的菌斑生物膜形成后，去除6孔板内的菌液并分别加入2 mL的PBS缓冲液(A组)、季铵盐溶液(B组)、多西环素溶液(C组)以及TMC-Lip-DOX NPs溶液(D组)共培养24 h。随后用5-DTAF对菌斑生物膜进行染色，并用荧光显微镜对其生物膜进行观察。同样以相同方法重复该实验3次，观察结果。

1.6 细胞相容性检测

选用HPDLFs体外以MTT法检测TMC-Lip-DOX NPs细胞相融性[14]。将密度为1×108个/L的细胞接种于96孔板内培养12 h后，弃去原液，用PBS洗涤2次后，分别更换为含体积分数0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5和0.031 25的TMC-Lip-DOX NPs，继续培养24和48 h。阴性对照组加入相同体积的空白培养基。随后，每孔加入10 μL浓度为5 g/L的MTT液，在37 ℃细胞培养箱中反应4 h。弃去培养基以后加入150 μL DMSO溶解10 min，使甲瓒晶体完全溶解，采用紫外分光光度计检测波长490 nm处的吸光度(A)值。相对生长速率用以下方程式表示：相对生长速率(%)=Dt/Dnc×100%，Dt和Dnc分别指测试样品的吸光度值和阴性对照的吸光度值。

1.7 TMC-Lip-DOX NPs体内毒性实验[15]

选取20只大鼠(雌雄各半)，体质量为(152.6±18.4)g，随机分成对照组和实验组(n=10)。实验组单次灌胃10 mL/kg的TMC-Lip-DOX NPs溶液，对照组单次灌胃相同剂量的生理盐水，每天1次，连续7 d。随时记录大鼠的行为活动状态，观察是否有呼吸困难、腹泻、眼睑下垂等中毒症状或死亡。1周后颈部脱臼法处死大鼠，并完整取出其心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，浸泡在40 g/L中性甲醛溶液中，24 h后脱水、包埋、切片、HE染色。在光学显微镜下观察组织有无病理改变。

2 结 果

2.1 TMC-Lip-DOX NPs的表征

从外观上看，合成的TMC-Lip-DOX NPs为乳白色浑浊液体(图1A)，超声后略变澄清(图1B)。透射电镜观察粒子的形态并拍摄照片，包载多西环素的脂质体为类圆形，季铵盐包裹后使部分脂质体聚集在一起，直径明显增大(图2)。采用激光粒度/Zeta电位分析仪测量的不同成分纳米粒及纳米粒不同pH环境下的直径、分散系数和电动电位的结果如表1所示。在同一pH值环境下(pH 7.2)，覆盖上季铵盐后(季铵盐脂质体纳米粒)直径明显增大,电位升高(B组)。当改变pH环境(pH 4.5)，季铵盐脂质体纳米粒电位反转为正电荷,并且随着pH值的降低，纳米粒的直径增加(C组)。在pH为7.2的环境下，加载多西环素得到的TMC-Lip-DOX NPs(D组)，其直径有了显著增大(F=36.98,P<0.01)，电位有了显著增高(F=39.88，P<0.01)，而各组之间的分散系数无明显差异(P>0.05)。见表1。

2.2 TMC-Lip-DOX NPs对游离混合菌的抑菌活性

对各实验分组的吸光值数据进行统计，A、B、C、D、E组的吸光值分别为1.64±0.13、1.27±0.19、0.99±0.23、1.34±0.15、0.48±0.04，与A组相比，季铵盐、多西环素、季铵盐脂质体、TMC-Lip-DOX NPs均有不同程度的抑菌效果，不同组的药物对相同混合菌的抑菌效果比较差异具有显著性(F=49.87)，其中TMC-Lip-DOX NPs的抑菌效果优于其他3种(P<0.01)。

图1 TMC-Lip-DOX NPs形态外观

A：80 kV,25 000倍，B：80 kV,150 000倍。

分组粒径(D/nm)分散系数电位(V/mV)A组103．2±3．50．19±0．10-22．23±1．07B组128．9±3．20．29±0．12-10．08±1．02C组158．0±3．00．17±0．07 9．32±0．63D组172．0±3．60．22±0．06 13．35±1．02

2.3 TMC-Lip-DOX NPs对于菌斑生物膜的抑菌效果

羟基磷灰石片与混合细菌共同培养24 h以后，5-DTAF染色后封片观察，菌斑生物膜24 h后形成，未经处理的生物膜作为A组(图3A)。季铵盐、多西环素和TMC-Lip-DOX NPs的抗菌性能具有显著差异。B、C组虽生物膜结构受到一定程度的破坏，但结构仍然存在，未彻底分解，而C组破坏程度明显大于B组(图3B、C)。D组生物膜的结构明显破坏，细菌数量显著减少，只有少量的游离细菌存在(图3D)。

2.4 细胞相容性检测

24 h条件下不同浓度TMC-Lip-DOX NPs作用下的细胞相对的生长速率分别为80.60%、88.14%、89.32%、98.88%、99.56%，48 h条件下不同浓度TMC-Lip-DOX NPs作用下的细胞相对生长速率分别为85.67%、87.90%、94.22%、98.10%、99.38%。不同浓度的TMC-Lip-DOX NPs作用下在不同时间段的细胞相对生长速率与阴性对照组比较差异均无显著性(P>0.05)。

2.5 急性毒性检测

连续1周灌胃给药后，实验组与对照组大鼠行为状态良好，均未出现死亡现象，病理检查各组大鼠的各内脏器官，未发现明显异常(图4)。

A、B、C、D分别为A、B、C、D组。5-DTAF染色，10倍。

A、B、C、D、E分别代表对照组的心、肝、脾、肺、肾，A′、B′、C′、D′、E′分别代表实验组的心、肝、脾、肺、肾。HE染色，200倍。

3 讨 论

本实验以带负电荷脂质体作为包载多西环素的核心载体，使用季铵化修饰得到的正电性季铵盐壳聚糖作为纳米粒外壳，季铵盐与脂质体间通过静电吸附作用而相互交联，从而形成了具有pH响应性的TMC-Lip-DOX NPs。当纳米粒通过电荷作用黏附在菌膜上，处于菌膜独特的低pH环境时，季铵盐壳聚糖中未进行季铵化反应的游离氨基发生质子化反应，从而使纳米粒外壳携带更多的正电荷，因而降低了纳米粒的稳定性而激发了脂质体内多西环素在菌膜病灶处迅速释放，以达到破坏菌膜，杀死病原菌的目的。

本实验结果显示，TMC-Lip-DOX NPs在水溶液中分散均匀，呈近似圆形，脂质体外包裹季铵盐后粒径明显变大，一方面，季铵盐包裹在脂质体外，增加了其原本的直径，另一方面，具有长链的阳离子TMC可以交联多个脂质体形成更大的颗粒[16]。当外界溶液中pH值降低时，纳米粒由原本的负电荷反转为正电荷，且粒径也随之增大。分析其原因是，当pH值降低后，脂质体外层的季铵盐发生质子化，使其表面带有更多正电荷，因而交联更多脂质体，使得纳米粒的直径明显变大。

壳聚糖是天然的阳离子多糖，具有安全无毒、生物可降解的特点[17]。将壳聚糖进行季铵化修饰能明显增强其水溶性和抑菌性，并能够携带永久正电荷，因而季铵基团修饰的壳聚糖的抗菌活性高于传统壳聚糖[18]。我们的实验分析结果表明，使用改性壳聚糖作为纳米粒外壳，能够显著地提高纳米粒对菌膜的黏附性，并大大提高药物的抑菌效率。针对TMC-Lip-DOX NPs对生物膜的作用机制，我们可归纳为三方面。第一，正电荷纳米粒能通过静电吸附作用聚集在带负电荷的细菌生物膜表面[19-20]。第二，抗菌纳米颗粒能有效渗透进入菌斑生物膜，导致细胞膜解体，细胞质内容外泄，最终导致细胞死亡。生物膜具有胞外聚合物作为保护性矩阵，可以获得对传统抗生素的耐药性，并阻止各种治疗剂的有效传递[21-23]。第三，季铵盐可以作为一种有效抑菌剂作用于菌膜内的胞外聚合物，导致菌斑生物膜结构破坏。这将促进多西环素对细菌的抑菌作用。

对于TMC-Lip-DOX NPs的安全性试验，我们进行了初步的研究，其中细胞相溶性实验和急性毒性实验是比较常用的实验方法[24-26]，用于避免材料应用于人体后出现严重的不良反应。本实验结果显示,各实验组细胞随着培养时间的延长，细胞相对生长速率没有显著性降低,形态良好,各不同浓度的TMC-Lip-DOX NPs组在各时间段相对生长速率与阴性对照组无显著差异，表明TMC-Lip-DOX NPs与牙周膜成纤维细胞具有良好的细胞相容性。而病理结果表明，其对大鼠也无明显的致毒作用，可初步说明此材料具有一定的安全性。对于临床应用具有一定的指导作用。

综上，本实验制得的TMC-Lip-DOX NPs粒径较小，具有较强的抑菌作用，毒性小，大大提高了抗生素在体内的作用效率，从而有助于减少临床中抗生素的滥用，具有广泛的应用前景。

[1] SAKANAKA A, KUBONIWA M, HASHINO E, et al. Distinct signatures of dental plaque metabolic byproducts dictated by periodontal inflammatory status[J]. Sci Rep, 2017,7:42818.

[2] KOPYTYNSKA-KASPERCZYK A, DOBRZYNSKI P, PASTUSIAK M, et al. Local delivery system of doxycycline hyclate based on epsilon-caprolactone copolymers for periodontitis treatment[J]. Int J Pharm, 2015,491(1-2):335-344.

[3] 刘骁,李禹. 牙周炎的病因及危险因素的相关研究进展[J]. 中国实用医药, 2009,4(24):99-100.

[4] 鲁纯,胡凡,徐艳,等. 菌斑生物膜原位干预模型的建立[J]. 口腔医学, 2009,29(4):174-176.

[5] KOO H, FALSETTA M L, KLEIN M I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm [J]. J Dent Res, 2013,92(12):1065-1073.

[6] HOREV B, KLEIN M I, HWANG G, et al. pH-Activated nanoparticles for controlled topical delivery of farnesol to disrupt oral biofilm virulence[J]. ACS Nano, 2015,9(3):2390-2404.

[7] QIN C, XIAO Q, LI H, et al. Calorimetric studies of the action of chitosan-N-2-hydroxypropyl trimethyl ammonium chloride on the growth of microorganisms[J]. Int J Biol Macromol, 2004,34(1-2):121-126.

[8] BOZZUTO G, MOLINARI A. Liposomes as nanomedical devices[J]. Int J Nanomedicine, 2015:975.

[9] 芦洁,祝林,金鸿莱,等. 盐酸多西环素脂质体凝胶剂的制备与评价[J]. 中国医药工业杂志, 2006,37(2):93-95.

[10] XU T, XIN M, LI M, et al. Synthesis, characterization, and antibacterial activity of N,O-quaternary ammonium chitosan[J]. Carbohydr Res, 2011,346(15):2445-2450.

[11] JIN Y, SONG Y, ZHU X, et al. Goblet cell-targeting nano-particles for oral insulin delivery and the influence of mucus on insulin transport[J]. Biomaterials, 2012,33(5):1573-1582.

[12] KONG M,HOU L, WANG J, et al. Enhanced transdermal lymphatic drug delivery of hyaluronic acid modified transfersomes for tumor metastasis therapy[J]. Chem Commun (Camb), 2015,51(8):1453-1456.

[13] 李永凯,段丁瑜,赵蕾,等. 牙周菌斑生物膜的体外模型建立[J]. 国际口腔医学杂志, 2012,39(1):37-42.

[14] 杨杨,季娟娟,彭蓓,等. 4种铸造合金对人牙龈成纤维细胞的毒性研究[J]. 实用口腔医学杂志, 2009,25(1):84-87.

[15] 张冬华,车向新,李卫东.自制 CPC 纳米复合材料溶血试验和短期全身毒性试验的研究[J]. 南昌大学学报(医学版), 2010,50(5):9-12.

[16] FANG B, JIANG Y, NUSSLEIN K, et al. Antimicrobial surfaces containing cationic nanoparticles: How immobilized, clustered, and protruding cationic charge presentation affects killing activity and kinetics[J]. Colloids Surf B Biointerfaces, 2015,125:255-263.

[17] 梁丽媚,李思东,李程鹏,等. 壳聚糖及其衍生物抗菌活性的研究进展[J]. 广州化工, 2017,45(20):6-9.

[18] WIARACHAI O, THONGCHUL N, KIATKAMJORNWONG S, et al. Surface-quaternized chitosan particles as an alternative and effective organic antibacterial material[J]. Colloids Surf B Biointerfaces, 2012,92:121-129.

[19] NG V W, KE X, LEE A L, et al. Synergistic co-delivery of membrane-disrupting polymers with commercial antibiotics against highly opportunistic bacteria[J]. Adv Mater, 2013,25(46):6730-6736.

[20] ALLAKER R P. The use of nanoparticles to control oral biofilm formation[J]. J Dent Res, 2010,89(11):1175-1186.

[21] Harvey J D. Periodontal microbiology[J]. Dent Clin North Am, 2017,61(2):253-269.

[22] DUNCAN B, LI X, LANDIS R F, et al. Nanoparticle stabilized capsules for the treatment of bacterial biofilms[J]. Acs Nano, 2015,9(8):7775.

[23] JONGSMA M A, VAN DER MEI H C, ATEMA-SMIT J, et al. In vivo biofilm formation on stainless steel bonded retainers during different oral health-care regimens[J]. Int J Oral Sci, 2015,7(1):42-48.

[24] 邓婧,刘梦东,许晓燕,等. 复方牡蛎根管充填糊剂的体外细胞毒性研究[J]. 上海口腔医学, 2007,16(4):410-412.

[25] 朱文军,程祥荣,潘杏兰,等. 新型羟基磷灰石涂层钛种植材料生物安全性的初步评价[J]. 口腔材料器械杂志, 2004,13(3):122-124.

[26] 张长源,程辉,王希,等. 反复熔铸Ni-Cr烤瓷合金体外细胞毒性实验(MTT法)[J]. 实用口腔医学杂志, 2010,26(3):306-309.