多模板液态活检技术在三阴性乳癌基因突变检测中的应用

PAUL Dempsey

(1 珠海市妇幼保健院乳腺外科，广东 珠海 519000； 2 珠海市中心血站；3 珠海丽珠圣美医疗诊断技术有限公司； 4 Cynvenio Biosystems, Inc.)

乳癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有120万妇女罹患乳癌。随着诊断技术与新药研发的发展，目前乳癌的治疗进入了分子分型的时代[1]。早在2013年，St.Gallen国际乳癌会议对乳癌分子分型进行了重新定义，将乳癌分为Luminal A型、Luminal B型、人表皮生长因子受体-2(HER-2)阳性和基底样细胞乳癌。同时，认为基底样细胞乳癌与三阴性乳癌(TNBC)的发病人群中一致率大约为80%。TNBC指的是雌激素受体、孕激素受体及HER-2均阴性表达的一类乳癌[2-3]，其发病率大约占乳癌病人的15%[4]。

TNBC病人多为年轻、绝经前女性(40岁前为主)。该肿瘤的内部异质性强，常伴有BRCA1突变，目前还没有发现可针对治疗的靶点或者免疫疗法。细胞毒性药物治疗是唯一的常用治疗手段，但耐药情况明显[5]，易发生淋巴结转移、复发或远处转移，预后效果不理想。大部分病人手术后3年内易发生复发或转移，且在复发后进展迅速[6]。多项研究显示，TNBC是复发率最高的乳癌亚型，高达1/3的病人会复发，包括首诊为癌症早期的病人[6-8]。然而目前还没有一种准确高效的方法在复发或者转移发生前或早期对病人进行有效的监测或评估。近年来，液态活检技术在临床上的应用，使对TNBC病人复发或转移的监测成为可能[9-10]。美国强生公司的CellSearchTM是全球第一个经过FDA和CFDA批准用于恶性肿瘤疾病管理的检测循环肿瘤细胞(CTC)的商业化产品，其适应证为转移性乳癌。然而单一的细胞计数功能并不能满足目前临床的需求[11-12]。除了CTC技术外，游离DNA(cfDNA)在肿瘤检测中的应用也进入快速发展的时期。美国Cynvenio公司为全球首家采取高纯度提取CTC及cfDNA进行DNA测序的企业，拥有该领域全球最新一代的高纯度分离技术，并通过自主开发软件和工作流程来进行罕见细胞的测序，相关产品包括TargetPrepTM与OncoPrepTM等。本研究旨在探讨多模板液态活检技术在TNBC复发及转移风险评估中的应用价值，以利于临床及时采取措施对病人进行干预。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该研究入组病人211例，年龄28～84岁，年龄中位数53岁。临床分期：Ⅰ期75例，Ⅱ期95例，Ⅲ期35例，Ⅳ期2例，未能提供信息4例。病人均经病理检查确诊为TNBC。共获得血标本826份，收集时间为2014年1月—2015年12月，病人的血标本来自美国多家医院。病人接受检测的时间间隔不少于3个月，每位病人跟踪采样3～5次。

1.2 检测方法

1.2.1对CTC突变情况的检测 每次检测需要采集病人血液8 mL。其检测步骤包括样本前处理、血液上机分离肿瘤细胞、CTC测序。CTC捕获分离平台为美国Cynvenio公司自主研发，其原理通过使用微流控免疫磁珠筛选及免疫荧光检测法定量检测全血中的上皮特征抗原阳性细胞。首先，向样本中加入生物素标记的捕获抗体、链霉亲和素标记的磁珠，其中捕获抗体为上皮特异性细胞黏附分子(EpCAM)。经过抗原与抗体特异性反应形成磁珠-捕获抗体-检测抗体的复合物1；同时向样本中加入荧光标记的CD45检测抗体，使其与白细胞表面的CD45抗原结合形成白细胞-CD45检测抗体复合物2；用核酸染料对细胞核进行染色。将处理后的样本及底部、顶部缓冲液同时通过鞘流芯片，密度关系为底部缓冲液>样本>顶部缓冲液，由于密度差异在芯片中形成鞘流，使样本不直接接触芯片，避免绝大部分复合物2的非特异性吸附。同时通过磁力将样本中的复合物1分离到鞘流芯片的上层，实现目标细胞的富集和分离(图1)。完成富集后，通过荧光显微镜扫描鞘流芯片，实现目标细胞的识别以及检测[13-14]。

1.2.2对cfDNA突变情况的检测 采用德国Qiagen QiAamp ccfDNA kit提取病人外周血液中的DNA。采集血样后4 h内进行处理，采用红细胞裂解液裂解红细胞，提取cfDNA。所用测序仪器为美国Thermo Fisher Ion Torrent S5XL，采用Thermo Ion Reporter软件以及Cynvenio TargetCall生物信息分析软件对测序数据进行分析。ClearIDTM为美国Cynvenio公司针对癌种定制的肿瘤检测试剂盒，本研究采用的为ClearIDTM定制的“27基因”乳癌检测试剂盒。

图1 鞘流示意图

1.3 结果判定及意义

ClearIDTM支持CTC和cfDNA的检测，报告阈值为1.0%，以该阈值为突变阳性判断标准。经过先前的实验验证，基因检测在正常的cfDNA以及以细胞为基础的质控中显示假阳性的概率为0.001 0%～0.000 7%。

1.4 统计分析

采用SPSS 21软件进行统计处理。采用卡方检验及McNemer检验比较样本中CTC及cfDNA突变阳性率，采用Kappa检验判断2种检测方法结果是否具有一致性[15]。

2 结 果

2.1 CTC与cfDNA突变检出结果

对211例病人标本进行检测显示，163例病人在至少一个标本中发现突变，48例病人在标本中未发现任何突变；59例检出突变的病人在连续2次采集的血标本中发现突变；18例病人在连续2次采集的标本中发现相同的突变；1例病人在连续2次采集的标本中发现CTC及cfDNA均有突变。

211例病人共采集826份血标本，其中，cfDNA标本突变的检出率为22.84%，CTC标本突变的检出率为19.84%，同一病人在cfDNA及CTC标本中都检出突变的概率为4.28%。同时，选取其中进行了cfDNA与CTC两项检测的病人共检测血标本194份，cfDNA和CTC两种检测结果差异有显著性(χ2=3.108，P<0.05)；2种检测结果的一致性较差(Kappa=0.091)。见表1。在373份检出突变标本中，TP53、PIK3CA以及EGFR突变的检出率分别为52%、33%、7%。

表1 194份血标本cfDNA及CTC检出突变情况 (份)

2.2 肿瘤复发病人的突变情况

截止到2017年5月，共有11例病人出现复发，复发部位10例为乳腺，1例为卵巢。11例病人从治疗到复发平均时间为21个月。对该11例发生复发的病人CTC及cfDNA情况进行分析，发现所有复发病人，都在连续的血标本中检测出肿瘤相关突变。对比11例复发病人的多次检测结果，在连续的检测中持续检出相同突变的概率为36%，而这些相同的突变中，仅有约50%可以在cfDNA与CTC中都被检出。

3 讨 论

本研究结果显示，大部分(77.25%)TNBC病人被发现在至少一个液体活检标本(cfDNA或CTC)中检测出了基因突变类型。其中，TP53、PIK3CA、EGFR为检出率最高的3种突变类型。TP53的检出率为52%，与已有研究结果相比较低[16]。TP53是人体重要的抑癌基因，在正常细胞中低表达，在恶性肿瘤中高表达[16]。TP53基因翻译的P53蛋白是细胞生长、增殖和损伤修复的重要调节因子[8,17-20]。PIK3CA以及EGFR都属于原癌基因[21-24]。EGFR一直是TNBC领域的研究热点[25]，三阴性乳癌中，EGFR阳性表达情况与肿瘤的组织学分级有关，与其治疗预后也有相关性[4,26-27]。这也为新药研发带来了启示，EGFR有可能会成为TNBC有效的治疗靶点[28-29]。

与无肿瘤复发的病人相比，出现肿瘤复发的病人均能在cfDNA或CTC检测中发现突变。而对比cfDNA与CTC的检测结果，认为两种检测源携带不一致的突变信息，同时检测cfDNA及CTC能够更完整地反映病人的基因突变情况，可以对病人的复发或转移风险做更准确的评估。

STOVER等[30]的一项Meta分析研究纳入了1 419例接受新辅助化疗前的乳癌病人，采用空心针穿刺乳腺组织获取标本后，综合分析其基因信息及临床特征。该研究认为，病人的病理完全缓解率和增殖相关基因发生突变的关系密切。针对TNBC病人，研究者筛选出60个具有预测价值的突变基因，其中有38个基因与细胞增殖相关。该研究也从理论层面表明了，可以通过对病人基因突变情况进行分析，用来作为TNBC病人复发及转移的评估预测方法。

液态活检技术在TNBC复发或转移的监测中有明显优势，该研究展示了使用多模板的方法连续监测的应用效果，认为连续监测的结果能够预测病人的复发及转移的风险。同时，通过对突变情况进行分析，也更好地理解了TNBC这种具有高度特异性肿瘤的生物学特点[4,23,26]。本项研究仍然需要进一步完善，因为随着随访时间的延长，可能会有更多的病人发现复发。通过对数据进行再次分析，可以得到更多对TNBC诊疗有指导意义的结果。

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