麦芽糖基-β-环糊精与10-姜酚的包合作用研究

于 博，李云捷，余海忠，汤尚文，吴进菊

（湖北文理学院 化学工程与食品科学学院，湖北 襄阳 441053）

生姜是卫生部首批公布的药食兼用植物资源，其在食品、药品、化妆品及农业杀害剂等领域有着广泛地应用。生姜中含有数十种具有生物活性的化学成分，主要包括酚类化合物、黄酮化合物以及挥发性的醛烯类[1]。姜酚是生姜中的多酚类物质，其具有抗氧化、抑菌、抗肿瘤、抗炎、强心、降压、降血脂、降血糖、抗凝血等多种生物活性[2]。愈创木酚和β-羟基酮结构是姜酚生物活性的官能团结构基础，苯环上连接的烃链长度对姜酚的生物活性具有较大影响。根据烃链长度，姜酚可分为6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚和12-姜酚等。在抗氧化能力上，3种常见的姜酚对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧自由基和羟基自由基的清除能力的顺序是10-姜酚＞8-姜酚＞6-姜酚[3]；在抗炎中对活性氧的抑制能力上10-姜酚＞8-姜酚＞6-姜酚[4]。研究还发现生姜的抗神经炎症能力主要取决于10-姜酚，而不是6-姜酚，这主要是由于烷基链长度的增加，姜酚的抗神经炎症能力不断增加[5]。10-姜酚还具有通过抑制酰化生长素的降解来改善厌食症的作用[6]。10-姜酚的研究目前还主要集中在分离纯化[7-9]和生物活性[10]的探索上，对姜酚生物活性的保护策略研究较少。但10-姜酚中存在的愈创木酚结构和β-羟基酮结构使得其具有非常活泼的理化性质，水溶性、热稳定较差，且易被降解和氧化，这极大地限制了其应用范围。目前提高姜酚稳定性的方法主要包括结构修饰方法和分子微胶囊法。本研究采用6-O-α-D-麦芽糖基-β-环糊精（6-O-α-maltosylβ-cyclodextrin，Mal-β-CD）包合10-姜酚的方法来稳定10-姜酚的生物活性有效态势。

分子微胶囊技术是通过分子间的相互作用，将客体分子全部或部分包埋到主体分子中，屏蔽外部不利环境因素，有效地或选择性地保护客体分子的特征官能团或活性中心。环糊精及其衍生物是分子微胶囊领域应用较多的一类主体分子，其化学性质稳定，具有疏水性空腔结构[11]，能够识别各类具有不同结构特征的非极性客体[12-15]，从而形成主客体复合物。6-O-α-D-麦芽糖基-β-环糊精（Mal-β-CD）是在母体环糊精上通过糖苷键连接麦芽糖基团形成的具有良好水溶性和安全性的主体分子，其包合能力与母体环糊精类似[16]。本研究采用溶剂法制备10-姜酚/Mal-β-CD包合物，借助紫外光谱、红外光谱、X-射线衍射技术、热重及差示扫描量热联用分析等技术研究包合物结构特征，并采用分子模拟对接技术构建10-姜酚/Mal-β-CD包合物的超分子结构，以期扩大10-姜酚在食品和医药等领域的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10-姜酚（纯度98%）：成都德斯特生物技术有限公司；6-O-α-D-麦芽糖基-β-环糊精（纯度98%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FD-1-50真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；D8 Advance X射线衍射仪：布鲁克AXS有限公司；SDTQ600同步热分析仪：美国TA公司；UV-2600PC紫外/可见光分光光度计、IRPrestige-21傅立叶红外变换光谱仪：岛津企业管理（中国）有限公司；QYC系列全温培养摇床：上海新苗医疗器械制造有限公司；DW-86L626超低温保存箱：青岛海尔特种电器有限公司；PGJ-10-AS（超）纯水机：武汉品冠仪器设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 10-姜酚/Mal-β-CD包合物及物理混合物的制备

称取1.459 g Mal-β-CD（1 mmol），用30 mL超纯水溶解，置于棕色瓶中，加入0.350 g 10-姜酚（1 mmol），在25 ℃恒温振荡器中，振荡反应72 h。离心后取上清液过0.45 μm膜，冷冻干燥制得10-姜酚/Mal-β-CD包合物。分别称取Mal-β-CD 1.459 g和10-姜酚0.070 0 g，混合均匀即为10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物。

1.3.2 紫外光谱分析

分别称取10mg的10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物及包合物，分别溶于体积分数为50%的甲醇溶液中，以体积分数50%甲醇溶液为空白对照，进行紫外全波长扫描。

1.3.3 傅里叶红外光谱分析

分别取3 mg的10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物及包合物，分别加入150mg溴化钾，压片后置于傅里叶红外光谱分析仪中，测定波数范围为4000～400cm-1，分辨率为0.01cm-1，扫描次数为32次，室温下进行红外光谱扫描。

1.3.4 X-射线衍射分析

分别取10mg的10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物及包合物，进行X-射线衍射。分析条件：室温，Cu靶（Kα射线，波长=1.541 87 Å），扫描电压40 kV，管电流40 mA，扫描速率2°/min，采样间隔0.02°，扫描范围为10～80 °。

1.3.5 热重及差示扫描量热同步分析

将5 mg左右的10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚/Mal-β-CD物理混合物及包合物进行同步热分析，记录其热分析图谱。测定条件为：在纯氮气环境下进行扫描分析，扫描温度范围为40～600℃，扫描速率为10℃/min。

1.3.6 分子对接

在ChemDraw12.0软件中构造10-姜酚，采用ChemDraw 3D 12.0软件中的MM2 Minimize功能模块对上述所有分子进行能量优化。Mal-β-CD分子的PDB文件来源于Pubmed数据库中[17]。运用AutoDock分子模拟软件，借助Vina模块将对接参数设置为对接中心，坐标为主体分子的中心对称点，对接盒子大小为20 Å×20 Å×30 Å，搜索步长为0.375 Å，计算构象数为10个，能差范围为10 kcal/mol，采用遗传学算法，其他参数均为默认设置。

2 结果与分析

2.1 紫外吸收光谱

在主客体超分子化学的研究中，通过比较超分子体系形成前后紫外光谱的变化，可以判断超分子形成过程中是否形成新的化学键，客体分子是否全部或部分进入到主体分子之中。10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚与Mal-β-CD包合物及混合物的紫外图谱如图1所示。由图1可知，Mal-β-CD在紫外范围内并无特征吸收峰，这主要是因为Mal-β-CD没有共轭双键结构；10-姜酚、10-姜酚与Mal-β-CD包合物及二者的物理混合物在紫外区均有吸收，这主要是由于10-姜酚具有苯环和β-羟基酮不饱和结构，而且三者的谱图峰位、峰形基本一致，这说明在包合物形成的过程中，并没有形成新的不饱和结构，10-姜酚与Mal-β-CD的相互作用可能是以非共价键的次级作用力为主导；根据二者分子结构特征，初步推断Mal-β-CD的疏水性空腔与10-姜酚的非极性基团发生了疏水相互作用。

图1 10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚与Mal-β-CD包合物及10-姜酚与Mal-β-CD混合物的紫外图谱Fig.1 UV spectrum of 10-gingerol,Mal-β-CD,10-gingerol and Mal-β-CD inclusion complex and 10-gingerol and Mal-β-CD mixture

2.2 红外光谱

红外光谱经常被用来研究包合物是否形成，通过对比主体、客体、二者物理混合物及其包合物的红外光谱图，通过特征吸收峰位置和强度的变化，来推断主客体间是否发生包合作用。图2为10-姜酚、Mal-β-CD、Mal-β-CD/10-姜酚包合物及其混合物的红外光谱图。由图2可知，10-姜酚在3 526 cm-1处具有O-H的伸缩振动峰，在波数1 649 cm-1处具有C=O的特征吸收峰，在1520cm-1、1609cm-1、1460cm-1、1 439 cm-1处具有苯环的特征吸收峰；Mal-β-CD的红外光谱具有羟基的伸缩振动峰（3 412 cm-1）、亚甲基的振动峰（2 928 cm-1）、糖苷键的伸缩振动峰（1 028 cm-1）。10-姜酚与Mal-β-CD物理混合物的特征吸收峰为二者红外光谱的叠加，这表明混合物中二者之间没有相互作用。10-姜酚与Mal-β-CD包合物的特征吸收峰与二者的物理混合物、10-姜酚的红外光谱明显不同，而与Mal-β-CD的红外图谱类似，在波数400～1700cm-1，10-姜酚的特征吸收峰减少明显，尤其是苯环的特征吸收峰基本被母体Mal-β-CD的红外光谱所掩盖，这说明二者发生了相互作用，形成了新的物相；和其他三个红外光谱相比较，包合物的图谱没有出现新的红外吸收峰，这说明在10-姜酚与Mal-β-CD的包合过程中没有形成新的共价键，主客体分子各自保留其原有的化学结构特征，包合物的形成不会影响到客体分子的生物功能特性。

图2 10-姜酚（1）、Mal-β-CD（2）、10-姜酚与Mal-β-CD包合物（3）、10-姜酚与Mal-β-CD混合物（4）的红外光谱图Fig.2 Infrared spectrogram of 10-gingerol(1),Mal-β-CD(2),10-gingerol and Mal-β-CD inclusion complex(3)and 10-gingerol and Mal-β-CD(4)mixture

2.3 X-射线衍射分析

X-射线衍射法在超分子化学的研究中具有广泛用途，其可以判断生成主客体固体包合物是否形成以及验证包合物的纯度。利用主客体晶体X射线衍射的不同，并对二者的物理混合物与包合物进行晶型解析，可以确证主客体分子间的包合作用。图3为10-姜酚、Mal-β-CD、10-姜酚与Mal-β-CD包合物及混合物的X衍射图谱。由图3可知，10-姜酚在2θ=12.888°、17.139°、17.819°、19.699°、20.806°、22.294°、25.066 °、25.423 °等处有尖锐的衍射峰，Mal-β-CD在2θ为10～15°和15～25°处有两处宽衍射峰，二者物理混合物的衍射峰大致为10-姜酚和Mal-β-CD衍射峰的叠加，由此可知，10-姜酚与Mal-β-CD直接混合后，其晶体类型均没有发生变化；包合物在2θ为10～15°和15～25°处的衍射峰与Mal-β-CD类似，客体分子10-姜酚的特征衍射峰在包合物中消失，晶体类型明显发生变化，这说明包合物中的10-姜酚分子的微环境发生了重大变化，这主要是由于10-姜酚的非极性基团与环糊精空腔通过疏水相互作用形成了新的物相，而致使包合物呈现出主体的无定形状态。

图3 10-姜酚（1）、Mal-β-CD（2）、10-姜酚与Mal-β-CD包合物（3）、10-姜酚与Mal-β-CD混合物（4）的X-射线衍射图Fig.3 X-ray diffraction pattern of 10-gingerol(1),Mal-β-CD(2),10-gingerol and Mal-β-CD inclusion complex(3)and 10-gingerol and Mal-β-CD(4)mixture

2.4 热重及差示扫描量热联用分析

热重/差示扫描量热联用可同时分析物质在升温过程中的重量变化和热量变化，通过重量与热量间的关系，分析物质的热稳定性、脱水过程以及熔融过程。热重/差示扫描量热联用技术广泛地应用于环糊精及其衍生物的包合物表征，能够精确地测量包合物热性质，判断包合物形成与否。重量变化是包合物形成的有力证据，通过对比10-姜酚、Mal-β-CD、二者包合物的同步热分析图谱，能够表征10-姜酚与Mal-β-CD的包合作用以及包合物形成后对10-姜酚的稳定性影响。10-姜酚、Mal-β-CD、二者包合物的热重（thermal gravity，TG）及差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）曲线如图4所示，由图4中Mal-β-CD的TG曲线可知，Mal-β-CD在温度低于275℃时，重量基本没有损失，说明其水分和挥发类组分很少；在270～450℃的升温范围内，失重明显，这主要是其发生热分解分子中的碳分解物逐步挥发所致；在450℃后重量趋于稳定，说明其此时已分解完全。由Mal-β-CD的DSC曲线可知，在280～350℃之间有一个显著的吸热峰，峰值温度为约313℃，这是由于其吸热分解引起。10-姜酚在165～330℃范围内，重量快速损失，重量损失约91%，其DSC曲线表明该范围内，10-姜酚吸热分解，峰值温度约为255℃，温度升至385℃左右时，重量趋于平衡。10-姜酚/Mal-β-CD包合物的TG曲线显示，在280～380℃范围内重量下降明显，而在160～260℃范围内，包合物重量没有明显降低，包合物的热重曲线与母体Mal-β-CD的热重曲线近似一致，10-姜酚的特征吸热峰消失，表明其不再以晶态形式存在，而是完全分散在母体Mal-β-CD中，热流数据显示，当温度达到300℃时，包合物才熔融并大量分解，这表明通过与Mal-β-CD的包合，10-姜酚的热稳定性得到了显著提高。

图4 10-姜酚（1）、Mal-β-CD（2）、10-姜酚与Mal-β-CD包合物（3）的热重及差示扫描量热图Fig.4 TG/DSC curve of 10-gingerol(1),Mal-β-CD(2),10-gingerol and Mal-β-CD inclusion complex(3)

2.5 分子对接分析

图5 10-姜酚与Mal-β-CD包合物三维超分子结构Fig.5 Three-dimensional supermolecular structure of 10-gingerol-Mal-β-CD inclusion complex

分子对接试验常用于预测主客体分子形成超分子复合物时的取向和相互作用机制，通过几何和能量匹配，环糊精的疏水性空腔与非极性基团完成相互识别。通过使用Autodock方法对包合物的三维超分子结构模拟，能够推断了包合方式，是研究超分子化合物的有效技术[18]。图5是10-姜酚与Mal-β-CD通过分子模拟建立的超分子模型。由图5可知，由于疏水相互作用，Mal-β-CD将10-姜酚的苯环和非极性侧链包埋到疏水空腔中，同时发现10-姜酚与Mal-β-CD超分子复合物中形成了4个氢键，氢键键长分别为2.5 Å、2.0 Å、2.4 Å、2.5 Å；10-姜酚与 Mal-β-CD包合物的化学计量为1∶1，结合能为-19.32kJ/mol。分子对接试验表明，Mal-β-CD通过包合10-姜酚，能够有效地保护其活性结构，这将有助于提高10-姜酚的抗热性和水溶性，这与同步热分析的试验结论相一致。

3 结论

10-姜酚是生姜中天然存在的酚类化合物，其具有良好的生物活性，在功能性食品、医药和化妆品领域具有广阔的应用前景。本研究采用溶剂法联合冷冻干燥技术制备了10-姜酚/Mal-β-CD的包合物，通过紫外光谱、红外光谱、X-射线衍射、热重及差示扫描量热联用技术表征了复合物的结构特征，证实Mal-β-CD对10-姜酚具有良好的包合能力。结合分子对接分析，10-姜酚的苯环结构进入到环糊精的疏水性空腔中，维持复合物稳定的作用力包括疏水相互作用和氢键；二者之间没有形成新的化学键，10-姜酚以无定形状态存在于包合物中，其热稳定性得到了明显提高。因此，以麦芽糖基-β-环糊精为分子胶囊的壁材，通过10-姜酚的微胶囊化，有助于拓展10-姜酚在功能性食品、药品及化妆品领域的应用范围。

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