副干酪乳杆菌ZG19发酵烟草废水产L-乳酸的响应面优化

陈 辰，朱润琪，刘 丽，马 轩，叶晓婉，杨增光，席 宇，朱大恒*

（1.郑州大学 生命科学学院，河南 郑州 450001；2.华中科技大学 药学院，湖北武汉 430074；3.北京诺禾致源科技股份有限公司，北京 301700）

作为一种重要的化工原料，L-乳酸在食品、纺织、化工、酿造、医药等行业的应用十分广泛[1-4]。由乳酸单体聚合而成的聚L-乳酸[5-7]可作为一种可用于制造绿色无污染的可降解塑料等材料，具有良好的应用潜力和社会效益。目前L-乳酸的生产方法主要有化学法和发酵法，鉴于化学法对环境造成的污染较大，目前已逐渐被环保、高效、清洁的微生物发酵法所代替[8]，发酵产L-乳酸的微生物主要有乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）和根霉菌属（Rhizopussp.）[9-11]，其中LAB是目前L-乳酸发酵的主要微生物类群。副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）是近年来引起关注的一类乳酸菌，刘云[12]用副干酪乳杆菌HD1.7在MRS培养基上发酵产L-乳酸，产量达到90 g/L。魏敏等[13]对副干酪乳杆菌耐受乳酸能力的研究，发现菌株可以在高浓度乳酸溶液中达到极高的活菌浓度。

寻找合适的废弃物或者廉价底料发酵产L-乳酸[14-17]，不仅能够降低污染[18]，实现资源的回收再利用，而且进一步降低了生产成本，已成为当前的热点领域。RUENGRUGLIKITC等[19]将玉米芯等农业有机废料作为发酵底料，利用乳酸菌作为发酵菌株，结果表明，乳酸的产率可达到300 g/kg。JINB等[20]利用少根根霉（Rhizopusarrhizus）DAR36017发酵玉米和土豆淀粉废水产乳酸，结果表明，乳酸产量为19.5～44.3g/L。MIURAS等[21]用Bacillussp.与Rhizopussp.MK-96-1196混合培养，直接发酵未经预处理的米糠等粗原料，结果表明，在100 g/L的粗原料中乳酸产量为24 g/L。在卷烟加工[22-24]、烟草薄片生产[25-28]过程中，均有大量富含可溶性糖、含氮化合物和矿物质等成分[29-32]的高浓度烟草废水产生，具有潜在资源化利用价值。

目前利用烟草废水发酵制备L-乳酸的研究尚未见其他实验室报道[33-34]，因此，利用副干酪乳杆菌发酵烟草废弃物制备L-乳酸具有巨大的开发潜力。本研究以分离鉴定的一株副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）ZG19为出发菌株，对菌株ZG19发酵烟草废水产乳酸的工艺条件进行优化，旨在为副干酪乳杆菌ZG19发酵烟草废水规模化制备L-乳酸和烟草废水的资源化综合利用提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌种

烟梗（直径为0.30～0.50 cm，长度为4.0～5.0 cm）：天昌国际烟草有限公司。副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）ZG19：由本实验室分离并保存。

1.1.2 试剂

氢氧化钠（分析纯）：上海试四赫维化工有限公司；盐酸（分析纯）：洛阳昊华化学试剂有限公司；酵母粉：英国OXOID公司；蛋白胨：郑州创生生物科技公司；吐温80（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；葡萄糖、碳酸钙（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；琼脂粉：美国Sanland公司。

1.1.3 培养基

MRS培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，柠檬酸三铵2g/L，葡萄糖20g/L，吐温-801mL，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸镁0.58 g/L，硫酸锰0.25 g/L，琼脂1.8%。

液体种子培养基：同MRS培养基，不加琼脂即可。

发酵培养基采用模拟烟草废水培养基[35]：烟梗60℃烘干至恒质量后用粉碎机粉碎成粉末状，取30 g烟梗粉末放入500 mL三角瓶，加入300 mL的蒸馏水（100℃），180 r/min振荡30 min后抽滤，滤液即为模拟烟草废水培养基。

1.2 仪器与设备

SYQ-DS2X-280B高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；HZQ-X100恒温振荡培养箱：太仓市实验设备厂；GHP-9160隔水式恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；TGL-16C台式离心机：上海安亭科学仪器厂；101型电热鼓风干燥箱：北京中兴伟业仪器有限公司；MP200A电子天平：上海精科天平仪器厂；SBA-40E生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所；PHS-3C精密pH计：上海鹏顺科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 种子液的制备

从MRS斜面培养基上挑取副干酪乳杆菌ZG19菌种，接入装液量为100 mL/250 mL液体种子培养基中，37℃、180 r/min培养14 h。

1.3.2 Plackett-Burman试验设计

选用N=12的Plackett-Burman（PB）设计对初选的影响ZG19发酵烟草废水产L-乳酸的7种相关因素：发酵温度、发酵液初始pH、发酵时间、装液量、接种量、CaCO3含量、发酵方式进行考察分析，以L-乳酸产量为响应值，每种因素取高（+）、低（-）两个水平，并余出4个空白项作为误差分析，高水平倍数不超过低水平2倍，因素之间间隔分布，7种因素与水平见表1。

表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

1.3.3 最陡爬坡试验设计

根据PB试验选取对L-乳酸产量影响最显著的3个因素：发酵温度、发酵时间和接种量进行最陡爬坡试验，由于这3个因素对白僵菌孢子产量都有明显的正效应，因此将其含量逐渐增加以此来寻找最佳响应区域，而发酵方式具有明显的负效应，所以采用静置发酵方式。根据PB试验结果设定变化方向与步长，具体设计如表2所示。

表2 最陡爬坡试验设计Table 2 Design of the steepest ascent experiments

1.3.4 Box-Behnken响应面试验设计

本试验主要采用Box-Behnken设计方法来进行发酵条件优化。通过Plackett-Burman试验确定发酵过程中影响L-乳酸产量的3个主要因素：发酵温度（A）、发酵时间（B）和接种量（C），进一步设计爬坡试验逼近最优条件附近，设计Box-Behnken试验进行3因素3水平响应面优化分析，各因素与水平取值见表3。

表3 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 3 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.5 数据处理

每个处理设置3个重复，采用Design-Expert 8.0.6进行数据统计和分析。

2 结果与分析

2.1 PB试验结果

2.1.1 Plackett-Burman设计及结果

根据表1选取的7个因素和水平进行PB试验，具体设计及结果见表4。从表4可以看出，L-乳酸产量响应值最小值为2.28 g/L，最大值为8.59 g/L，变化幅度较大，差别明显，表明所选因素的改变对L-乳酸的产量有显著影响。

表4 Plackett-Burman试验设计及结果Table 4 Design and results of Plackett-Burman experiments

2.1.2 PB试验各因素效应分析

各因素的影响度和模型贡献率如表5所示。影响度是指模型中的某个因素从低水平（-1）向高水平（+1）变化时对模型响应值所产生的影响，其中负值表示该因素对响应值具有负效应，并且影响度值越大说明该影响因子对响应值的影响越显著[36]。贡献率是指模型中某因素的平方和占模型中各因素平方和的总和的百分比，其值大小表明了该因素对响应值影响程度的大小，贡献度越大表明该因素变量在模型中的作用越大[37]。从表5可看出，不同因素差别很大，其中接种量的影响度和贡献率均最高，分别为1.83和34.87%，其次为发酵温度，影响度和贡献率分别为1.50和23.34%，时间对L-乳酸产量的影响仅次于接种量和温度。接种量影响发酵延滞期的时间[38]，发酵温度对菌株的生长和发酵具有重要作用，发酵时间则会影响发酵产物的积累。此外，发酵方式对L-乳酸的产生积累具有明显的负效应，表明菌株ZG19发酵产乳酸是一个厌氧过程，增加转速导致发酵液溶氧增加，抑制乳酸的合成。

表5 Plackett-Burman试验因素效应分析Table 5 Factors effect analysis of Plackett-Burman experiments

2.1.3 PB试验结果方差分析

对PB试验结果进行方差分析，结果见表6。P值表示样本间差异的显著性水平，P＜0.05表明样本之间具有显著差异，P＜0.01表明样本间的差异极显著。由表6可知，本模型的P＜0.001，表明该模型高度显著，在整个回归区域里拟合度良好，具有实际意义，可用来评估各个因素对L-乳酸产量的影响。在所选取的因素中，发酵温度、初始pH、发酵时间、接种量的P值均小于0.01，表明这些因素对ZG19发酵烟草废水产L-乳酸都有极其显著的影响，其中发酵温度、初始pH、发酵时间、接种量具有显著的正效应，发酵方式则具有显著的负效应，具有统计学意义。

根据各因素影响度、贡献率和方差分析综合评价，确定发酵温度、发酵时间、接种量为副干酪乳杆菌ZG19发酵烟草废水产L-乳酸的主要正效应因子，发酵方式为主要负效应因子。因此，在后续试验中采取静置发酵方式，并对发酵温度、发酵时间和接种量做进一步优化。

表6 Plackett-Burman试验结果方差分析Table 6 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

2.2 最陡爬坡试验结果

根据PB试验结果，对菌株ZG19发酵烟草废水产L-乳酸影响最显著的3个正效应因素：发酵温度、发酵时间、接种量设计最陡爬坡试验，结果如图1所示。

图1 最陡爬坡试验结果Fig.1 Results of the steepest ascent experiments

由图1可知，随着发酵温度、发酵时间和接种量的增加，L-乳酸产量逐渐升高，并且不同试验组对L-乳酸产量影响显著（P＜0.05）。在发酵温度38℃，发酵时间32 h，接种量（第5组）10%时，L-乳酸产量达到最大值。因此，选取此条件为中心点，每个因素取3水平，以（-l，0，1）编码，设计Box-Behnken响应面试验，以筛选出发酵温度、发酵时间和接种量的最优配比。

2.3 响应面优化试验结果

2.3.1 Box-Behnken试验设计结果及方差分析

对选取的3种主要效应因素发酵温度（A）、发酵时间（B）和接种量（C）进行Box-Behnken试验设计，响应值为L-乳酸产量（Y），设置17个试验点，其中12个试验点为析因点，其余5个试验点为零点，结果见表7。

以L-乳酸产量作为响应值，根据表7中Box-Behnken试验设计及结果，进行二次回归分析，得到回归方程为Y=-460.50000+9.37500A+5.90625B+40.62500C-0.03125AB+0.125 0AC+0.0109 2BC-0.1250 0A2-0.0781 25B2-2.25C2。对回归方程各项进行方差分析，结果见表8。从表8可以看出，模型的P值＜0.000 1，说明此模型具有极高的显著性，并且经过校正后回归方程决定系数R2Adj为98.69%，表明方程的拟合度良好，变异系数为1.44%，值较小，表明试验结果可靠。

表7 Box-Behnken试验设计及结果Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments

表8 回归模型方差分析Table 8 Variance analysis of the regression model

2.3.2 响应面分析及最佳发酵条件的确定

根据回归方程绘制响应面和等高线图，结果如图2所示，从图2可以看出，发酵温度、发酵时间的交互作用以及发酵温度、接种量的交互作用明显，而发酵时间和接种量之间的交互作用不明显。从响应面图和模型分析可知回归方程存在最大值，得到最优条件为：发酵温度38.80℃，发酵时间30.04 h，接种量10.11%时，L-乳酸产量理论最优值为15.35 g/L。

图2 发酵温度、发酵时间和接种量相互作用对L-乳酸产量影响的响应面及等高线Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,time and inoculum on L-lactic acid yield

2.3.3 模型验证

通过Box-Behnken响应面优化得到副干酪乳杆菌ZG19发酵烟草废水产L-乳酸的最佳发酵条件为：发酵温度38.80℃，发酵时间30.04 h，接种量10.11%时，L-乳酸产量理论最优值为15.35 g/L。为方便实际操作，在发酵温度39℃，发酵时间30 h，接种量10%条件下进行验证试验，得到实际L-乳酸产量为15.16 g/L（3次重复平均值），与模型预测值拟合度达到98.76%，表明通过响应面法对副干酪乳杆菌ZG19发酵烟草废水产L-乳酸工艺条件的优化合理而有效，具有实际意义。

3 结论

通过响应面优化试验，得到副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）ZG19发酵烟草废水产L-乳酸的最佳工艺条件为发酵温度39℃，发酵时间30 h，接种量10%时，静置发酵，实际L-乳酸产量为15.16 g/L，与模型预测最优值（15.35 g/L）拟合度达到98.76%，相比PB试验L-乳酸产量显著提高达到了76.5%。本研究探究并优化了副干酪乳杆菌ZG19发酵烟草废水产L-乳酸的发酵工艺，显著提高了L-乳酸产量，具有良好的开发潜力和应用价值，为烟草废水、烟草废料的资源化利用开辟了新途径。

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