食品黄曲霉毒素总量检测方法的研究与应用

王亚楠, 王晓斐,王自良*

1(河南科技学院 动物科技学院，河南 新乡，453003) 2(河南科技学院 新科学院，河南 新乡，453003)

黄曲霉毒素(aflatoxin，AF)是由黄曲霉(Aspergillusflavu)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)经聚酮途径所产生的含有二呋喃环和氧杂萘邻酮结构相似的一组有毒次生代谢产物[1]。AF对人体健康具有急性、慢性、致癌、免疫抑制等多种毒性危害作用，自然条件下产生的AF主要包括B1、B2、G1、G2四种，且这4种毒素残留对人体健康的毒性往往具有协同和加性效应，实施黄曲霉毒素总量(total aflatoxins，TAFs)检测已成为当前食品质量安全检测领域发展的必然趋势[2]。针对这一新的限量要求及在食品国际贸易中的作用，世界上许多国家都展开了TAFs最大残留限量(maximum residue limit，MRL)及检测方法的研究，至 2013 年已有 91 个国家制定了TAFs在不同食品中的MRL，如国际食品法典委员会(CAC)和美国食品与药物监督管理局(FDA)等规定食品中TAFs的MRL为15 μg/kg，日本为10 μg/kg，欧盟(EC)为4 μg/kg，我国现行的《GB 2761—2011 食品中真菌毒素限量》标准中规定了AFB1的限量标准，尚未涉及TAFs限量要求，但在《GB/T 5009.23—2006 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定》标准中规定了TAFs限量检测方法[3]。

食品中TAFs检测方法目前主要有生物分析法(bioassay，BA)、理化分析法(physicochemical analysis，PCA)和免疫分析法(immunoassay，IA)三种，本文就食品中TAFs检测方法的研究进展、应用情况、技术优势与缺陷及今后的发展趋势进行探讨，旨在为食品TAFs检测方法的选择使用和发展完善提供借鉴和思路。

1 生物分析法

BA的基本原理是通过生物体实验来验证样品的毒性部位和毒性机理，以染毒动物摄入后胆管异常增生程度为主要根据，判断毒物含量的多少[4]。此法最早应用于雏鸭，后经不断发展，派生出其他的生物分析法，主要包括鸡胚法、软体动物卵试验法、组织培养法、豚鼠鉴定法、皮肤毒性实验法、种子发芽实验法、微生物鉴定法等。BA的优点是对样品纯度要求不高，设备要求简单。其缺点是专一性不强，灵敏度较低，操作繁琐，费用较高，目前除在机体对毒素耐受性和毒理学研究应用外，实际检测中已很少使用[5]。

2 理化分析法

目前各国主要采用的理化分析方法有薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)、高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)、时间分辨荧光分析法(time resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA)等，分述如下。

2.1 薄层色谱法

TLC的基本原理是将样品经过提取、浓缩、薄层分离后，在365 nm紫外激发显色，其中B1、B2产生蓝紫色荧光，G1、G2产生黄绿色荧光，以此来确定TAFs，为半定量分析方法[6]。该方法于1963年由BROADBENT等[7]建立，后经不断发展，根据其展开方法又分为单向展开法和双向展开法，后者灵敏性更好。TCL的优点是所需仪器设备简单，操作简便，易于普及，是TAFs检测较为经典的方法，目前国内外仍在使用。其缺点是样品前处理复杂，操作繁琐，耗时耗力，干扰因素多，测定结果的准确性差。ROBB等[8]采用该方法检测样品中TAFs，B1、B2、G1、G2的检测限(limit of detection，LOD)均可达到0.5 μg/kg。1990年，该方法被美国官方分析化学家协会(Association of Official Agricultural Chemists，AOAC)列为标准方法[9]。我国国家标准中《食品黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定》仍采用TLC法[10]。OTTA等[11]于2000年研究报道了过压薄层色谱法(overpressured-layer chromatography，OPLC)，可同时检测食品中B1、B2、G1和G2，实现了TAFs检测，检测灵敏度达1 μg/kg，符合欧盟对食品TAFs的MRL标准。

2.2 高效液相色谱法

HPLC的原理是样品经过净化后，在适宜的流动相下，采用反相C18色谱柱对TAFs进行分离，依据每种AF的荧光特性，在荧光检测器作用下，实现TAFs的定性和定量检测[12]。该方法由RAO等于1973年建立，可同时检测B1、B2、G1、G2，LOD为1 μg/kg，后经不断发展，派生出正相液相色谱法(normal phase HPLC，NP-HPLC)和反相液相色谱方法(reversed phase HPLC，RP-HPLC)，其中RP-HPLC 的灵敏性与稳定性更好，RP-HPLC更受使用者青睐，但RP-HPLC对AF分子具有选择性，即对B2、G2的灵敏度高，而B1和G1的荧光强度在含水的溶剂中容易发生淬灭致使灵敏度很低甚至无法检出，需要进行柱前或柱后衍生以增强其荧光性[13]。HPLC的优点是分辨率高，结果可靠，灵敏度高，能够自动化操作，适于大批量样品的定性、定量和多元分析，是国内外食品TAFs定量检测方法中最权威、最易被接受的方法。其缺点是仪器设备昂贵，技术水平要求高，样品需要进行前处理，不适合快速、现场检测[14]。朱鹏飞等[15]采用三氟乙酸柱前衍生-RP-HPLC测定食品中TAFs，结果表明，对B1、G1的LOD为0.1 μg/kg，对B2、G2的LOD为0.03 μg/kg，精密度为0.13%～9. 5%，加标回收率为70%～106%。吴燕等[16]采用化学柱后衍生-RP-HPLC测定粮谷类食物中TAFs，结果表明，对B1、B2、G1、G2的LOD分别为0.50 μg/kg、0.15 μg/kg、0.50 μg/kg和0.15 μg/kg，加标回收率为86.7%～97.2%。无论柱前或柱后衍生，RP-HPLC灵敏度高，重现性好，能够很好满足食品中TAFs检测的需要。

2.3 高效液相色谱-串联质谱法

HPLC-MS/MS的基本原理是使用合适的接口技术将HPLC与串联质谱联结起来，它将HPLC的高效分离能力和MS的高灵敏度这两种优势结合在一起，实现多种化合物的定性和定量分析[17]。HPLC-MS/MS的优点是具有快速，高效，分辨率高，微量进样和自动化，相比于HPLC，无需进行柱前或柱后衍生处理，操作相对简捷，有很大的优势，使用越来越广泛。其缺点是仪器设备昂贵，专业技术人员水平要求高[18]。MCCULLUM等[19]用HPLC-MS/MS检测食品TAFs，结果表明，检测范围为0.006～3.0 μg/kg，对B1、B2、G1、G2的LOD分别为0.001 2、0.001 2、0.001 2 μg/kg和0.003 1 μg/kg，加标回收率为97.0%～108.0%。王岩松等[20]用HPLC-MS/MS检测谷物中TAFs，结果表明，对B1、B2、G1、G2的LOD分别为0.1、0.1、0.2 μg/kg和0.3 μg/kg，加标回收率为74.6%～89.6%，通过实际检测应用，谷物样品中B1、G1残留量为5.86 μg/kg和8.6 μg/kg，B2、G2未检出。

3 免疫分析法

目前已建立的TAFs免疫分析法有酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbant ssay，ELISA)、胶体金免疫层析法(gold immunochromatographic assay，GICA)、荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay，FIA)和免疫传感器法(immunosensor，IS)等。

3.1 酶联免疫吸附法

ELISA检测小分子半抗原的原理是将抗原(或抗体)包被于酶标板，同时加入抗体与待测半抗原(或酶标半抗原与待测半抗原)，抗原与待测半抗原(或酶标半抗原与待测半抗原)共同竞争抗体的抗原结合位点，洗板后酶标板上仅留下抗原与抗体(或酶标半抗原与抗体)反应结合的抗原抗体复合物，复合物的量与待测半抗原的量呈负相关，通过酶底物催化显色，根据颜色的深浅有无对待测半抗原进行定性和定量检测。分析方法包括间接竞争ELISA(indirect competitive ELISA，icELISA)和直接竞争ELISA(direct competitive ELISA，dcELISA)两种技术模式。ELISA的优点是快速方便、操作简单、成本较低、筛检样品量大。缺点是由于抗体与酶均属生物活性物质，需要低温保存，易受环境和反应条件影响，稳定性差；存在非特异性反应，检测结果易出现假阳性问题；样品萃取需要脱脂、脱盐、调节pH等，样品前处理复杂。LI等[21]用筛选出的10C9细胞株所分泌的mAb建立了TAFs ciELISA检测方法，检测范围为2.1～3.2 μg/kg，添加回收率为87.5%～102.0%。KIM等[22]用筛选出的8H10细胞株所分泌的mAb建立了TAFs dcELISA检测方法，检测范围为0.2～25 μg/kg，添加回收率为79.18%～91.27%。计融等[23]用自制的TAFs mAb研制出食品TAFs快速检测ELISA试剂盒，其对FAFs B+G标准品的LOD为0.26 μg/kg，检测范围为0.26～20.00 μg/kg，对Bl、B2、Gl和G2的CR分别为100%、57.5%、104.0%和19.0%，对玉米3个加标回收率分别为98.63%、94.56%和112.05%，对花生的3个加标回收率分别为88.66%、87.50%和85.60%。目前，国内外许多公司研发出商品化、标准化的TAFs检测ELISA试剂盒，在灵敏性、特异性、准确性、稳定性、适用性等方面均有良好的表现，已成为TAFs检测的重要手段。如ZHENG等[24]用新加坡Biomin公司的TAFs ELISA试剂盒检测玉米、高粱、小麦、大米、大豆、花生和棉籽等样品，LOD为4.0 μg/kg，检测范围为4.0～40.0 μg/kg。IQBAL等[25]用美国Romer Labs科技公司的TAFs ELISA试剂盒对120个糙米样品进行检测，并用TLC、HPLC和LC-MS/MS进行验证，结果表明，ELISA试剂盒的LOD为1.0 μg/kg，检测范围为1.0～40.0 μg/kg，加标回收率范围为83.2%～90.4%，实际检出阳性88个，样品TAFs值为1.24～11.68 μg/kg，检测结果与TLC、HPLC和LC/MS-MS的检测结果完全一致，检测灵敏度ELISA试剂盒优于TLC，但稍低于HPLC和LC/MS-MS。

3.2 胶体金免疫层析法

GICA检测小分子半抗原的原理是当样品中不含小分子半抗原时，游离的金标抗体与固定在膜上的半抗原结合形成红色条带，检测结果呈阴性；当样品中含有小分子半抗原时，其与游离的金标抗体结合，抑制了金标抗体与固定在膜上的半抗原结合，样品中小分子半抗原的含量决定了膜上红色条带的深浅或有无，检测结果呈阳性。GICA的优点是快速、简便、特异性强、稳定性好、可现场检测、筛检样品量大。缺点是只能定性或半定量检测，无法准确定量；检测灵敏度不及ELISA、HPLC和LC/MS-MS[26]。ANFOSSI等[27]利用自主研制的B族、G族混合单抗研制出TAFs检测试纸(test strip)，LOD为1.0 μg/kg，检测范围为1.0～40.0 μg/kg，用test strip对25个玉米样品进行检测，并用HPLC进行确证，检测结果与HPLC完全相符。ZHANG等[28]用自主制备的1C11杂交瘤所分泌的单一通用单抗研制出TAFs test strip，LOD为0.46 μg/kg，对Bl、B2、Gl和G2的LOD分别为0.03 μg/kg、0.06 μg/kg、0.12 μg/kg和0.25 μg/kg，用test strip检测花生样品，对检出的20个阳性样品分别测定TAFs污染组分，并用HPLC进行确证，结果表明，同时检出Bl、B2、Gl和G2污染样品0个，同时检出Bl、B2和Gl污染样品3个，同时检出Bl和B2污染样品18个，只检出Bl污染样品1个，只检出B2污染样品1个，检测与HPLC完全一致。徐振斌等[29]应用美国Clover Icheck公司的TAFs test strip对市售96个玉米样品进行筛检，检出的5个阳性样品用HPLC确证，Test strip的LOD为1.0 μg/kg，相对标准偏差(RSD)小于15.2%，加标回收率范围为82.4%～95.8%，test strip的检测结果与HPLC的检测结果完全一致。

3.3 荧光免疫分析法

FIA的原理是基于荧光未标记的抗原(Ag)和荧光标记抗原(Ag-F)共同竞争结合抗体(Ab)的有限位点而实现的免疫分析方法，目前已建立的用于TAFs检测的FIA主要包括荧光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)和时间分辨荧光免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)两种。

3.3.1 荧光偏振免疫分析法

FPIA检测小分子半抗原的原理是用荧光物质标记抗原或抗体，抗原抗体进行特异性结合反应后，依据抗原抗体结合物荧光偏振程度的差异，用竞争性方法测量待测样品中小分子化合物的含量。分析方法包括置换(single-reagent FPIA)、停流FPIA(stopped-flow FPIA)和有机介质FPIA(organic medium FPIA)三种技术模式。FPIA的优点是高通量、速度快、操作简便、检测成本低、定量检测和可大批量快速筛选样本。缺点是由于存在基质效应导致有假阳性、由于需要专门荧光偏振设备导致仪器成本高、由于多采用杯式检测装置导致试剂用量大且检测效率低[30]。NASIR等[31]用研制的TAFs族特异性单抗建立FPIA，检测谷物样品包括玉米、高粱、花生油、花生酱中TAFs残留，并与HPLC比较确证，添加回收试验结果表明，TAFs混合物Bl/B2/Gl/G2按重量比为7/1/3/1，FPIA的LOD为1.0 μg/kg，检测范围为1.0～32.0 μg/kg，检测结果与HPLC的检测结果完全一致，研究结论为FPIA可用于TAFs检测。SHENG等[32]用广谱性较强的抗AFB1单抗建立FPLA，其对AFB1的IC50值为23.33 μg/kg，LOD为13.12 μg/kg，对Bl、B2、Gl和G2的CR分别为100%、65.7%、143%和23.5%，所建立的FPLA可用于TAFs的检测。

3.3.2 时间分辨荧光免疫分析法

TRFIA检测小分子半抗原的原理是使用镧系元素(Eu、Tb、Sm、Dy等)长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。TRFIA的优点是操作简便、灵敏度高、检测线性范围宽、重复性好、试剂保存时间长、无污染危害等，TRFIA是目前公认的最为敏感的免疫学分析方法。缺点是试剂纯度要求较高、镧系元素离子螯合物的合成难度较大、标记多个靶标物难度大进而多元检测受到局限等[33]。DEGAN等[34]最早研究报道，以Eu3+标记广谱性的AFB1多克隆抗体，建立TRFIA用于TAFs检测，并与ELISA方法进行了比较，对TAFs的LOD为0.004 μg/kg，检测范围为0.004～4 μg/kg，其灵敏度高于ELISA。WANG等[35]用Eu3+纳米球标记广谱性的TAFs单抗，建立了用于TAFs检测的金纳米TRFIA(Eu-Nano-TRFIA)，该方法检测TAFs包括Bl、B2、Gl和G2四种，检测时间12 min，LOD为0.16 μg/kg，检测范围为0.16～30.0 μg/kg，加标回收率为83.9%～113.9%，变异系数(CVs)为3.5%～8.8%，对397个饲料原料样本进行实际检测，阳性检出率为78.3%，阳性样本TAFs浓度值为0.50～145.30 μg/kg，其中棉籽饼种TAFs含量最高为18.48 μg/kg。该方法与HPLC、ELISA、GICA相比，具有灵敏、准确、快速等优点，能够更好地满足食品FA总量污染残留检测的需求。

3.4 免疫传感器法

IS检测小分子半抗原的原理是IS由抗原或抗体与换能器组成，待测样品中小分子半抗原与固化在传感器表面的特异性抗体反应形成抗原抗体结合物，结合物量的大小决定IS的电荷信号，换能器根据电荷信号的强弱变化，达到检测待检半抗原的目的。IS根据传感技术原理可分为光学免疫传感器、电化学免疫传感器、热量免疫传感器和质量免疫传感器四种技术模式[36]，目前已建立了用于TAFs检测的光学免疫传感器[37]和电化学免疫传感器[38]。IS用于TAFs检测的优点是携带方便、操作简单、成本较低、可自动化检测。其缺点是抗原抗体固化技术不够成熟、灵敏度与精密度需要进一步提高、难以实现多元检测和难以实现批量生产[39]。KONG等[40]用纳米金研制出半定量和定量IS，实现了霉菌毒素的多元IS检测，可同时检测霉菌毒素20种，其中选择敏感、特异的TAFs族广谱性单抗，可同时检测Bl、B2、Gl和G2，LOD为0.25 μg/kg，检测范围为0.25～4.0 μg/kg。

4 结语

比较各种食品中TAFs检测方法，BA法专一性差，灵敏度低，主要用于定性分析，现已很少应用；PCA 法具有灵敏、特异、准确等优点，但存在仪器设备昂贵、技术要求高、成本高、周期长，难以实现现场检测与快速检测的行业需求；IA法具有快速、简便、特异性强、稳定性好、可现场检测、筛检样品量大等优势，是实现TAFs检测的主要技术手段和发展趋势。在IA法的选择与建立方面，随着抗体标记技术如酶标记、纳米金标记、荧光标记、量子点标记等的逐步完善和新的标记技术如镧系元素标记等的不断出现，IA技术正向灵敏、快速、准确、高效、操作简单的方向发展，将在TAFs检测中发挥重要作用，对于推动我国食品安全免疫检测技术的快速发展具有积极意义。

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