超声波辅助酶解鲭鱼制备抗氧化肽的研究

周燕芳　杨启真

摘 要：针对鲭鱼鱼肉蛋白质含量相对较高的特点，利用超声波辅助酶解制备抗氧化肽。以双缩脲法测得多肽含量，以对DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基的清除率为指标，探究制备鲭鱼抗氧化肽的最佳工艺条件。结果表明，最佳的酶解制备条件为：中性蛋白酶加酶量3%、酶解温度50 ℃、底物浓度4%、超声波辅助酶解时间2.5 h，在此条件下，得到的多肽抗氧化能力较强，对DPPH自由基的清除率达到89.33%，采用中性蛋白酶在超声波辅助下酶解鲭鱼蛋白制备抗氧化肽是可行的。

关键词：鲭鱼；抗氧化肽；超声波；DPPH清除率；酶解

中图分类号：TS254 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.03.006

Abstract： According to the characteristics of high protein content in mackerel， the antioxidant peptides were prepared by ultrasonic assisted enzymatic hydrolysis. The content of polypeptide was measured by the biuret method， and the DPPH （1，1- two -2- three nitro phenyl hydrazine） free radical scavenging rate was used as the evaluation index to explore the technological conditions for preparing mackerel antioxidant peptides. The results showed that the optimal preparation conditions for enzyme solution was as following： neutral enzyme amount of 3%， the enzymolysis temperature of 50 ℃， substrate concentration of 4%， ultrasonic assisted enzymatic time of 2.5 h. Under these conditions， polypeptide were obtained with strong antioxidant activity， DPPH radical scavenging rate reached 89.33%. It is feasible to prepare antioxidant peptides by enzymatic hydrolysis of mackerel protein by neutral protease.

Key words： mackerel； antioxidant peptides； ultrasonic； DPPH clearance； enzymolysis

随着海洋生物资源研究的不断深入，来源于海洋生物的低分子多肽活性和抗氧化性被广泛认可，海洋生物抗氧化肽类大致分为自身存在的活性抗氧化肽及其蛋白质降解后产生的活性肽两类，前者含量相对较少，故活性抗氧化肽來源主要依赖蛋白质降解所产生[1]。抗氧化活性肽一般是含有10～30个氨基酸组合、分子量小于6 000 Da的多肽化合物，易被人类肠道所吸收利用。因此，作为海洋生物重要物种的鱼类成为生物抗氧化肽的理想来源 [2]。目前对鱼类中多肽的研究已有很多报道，多集中于鱿鱼[3]、大黄鱼[4]、鳙鱼[5]等。鲭鱼又名鲭花鱼，俗名鲐鱼、青鲇鱼、油胴鱼、鲭鱼、青条鱼，是我国重要的中上层经济鱼类之一，此种鱼类分布广、生长快、产量高，且具有丰富的蛋白质、多肽和氨基酸等物质，其中蛋白质含量高达20%以上，除鲜食外还可腌制和做罐头，同时亦是生物抗氧化肽的理想来源，但目前有关采用超声波协同酶解鲭鱼获得抗氧化肽方面的研究尚未见报道。

本试验主要通过超声波辅助蛋白酶对鲭鱼蛋白进行酶解制备抗氧化肽，并对酶解得到的多肽抗氧化性进行研究，旨在对鲭鱼的进一步开发和综合利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

临海鲭鱼鲜肉冻块剔骨打浆后，平铺置于试验盘中冰箱冷冻，呈块状。

1.2 试验试剂和仪器

中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、酸性蛋白酶均由锐阳生物科技有限公司提供；牛血清蛋白（BSA）由上海如吉生物科技发展有限公司提供；DPPH（ 2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味酰肼自由基）由日本TCI原装进口；其他试剂均为市售分析纯。

FA2004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；超声波清洗机（广州市科洁盟实验仪器有限公司）；722S可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；85-2恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）；HH-2数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；KDM型调温电热套（山东省鄄城永兴仪器厂）；玻璃仪器气流烘干器（巩义市予华仪器有限责任公司）；SDH-Ⅲ循环水式多用真空泵（上海丞明仪器设备有限公司）；高速离心机（上海手术器械厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 酶解前处理鲭鱼 除去鱼鳞、鱼内脏、鱼头和鱼尾，剔除鱼头留下鱼肉，冷冻、备用。

1.3.2 酶解制备工艺单因素试验 （1）最适蛋白酶筛选。试验设置中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶4个处理。称取定量鲭鱼样品，配制成底物浓度为4%的鱼蛋白液，置于搅拌器中持续搅拌15 min作为样液，将4组样液置于恒温55 ℃、功率120 W的超声波清洗机中，恒温超声5 min后，分别按4%的加酶量（加酶质量占底物质量的百分比，下同）加入4组样品中，恒温超声波辅助酶解1 h，完成后置于沸水浴灭酶10 min，冷却至室温后抽滤，滤液用蒸馏水定容，测定其肽含量和抗氧化能力，每个处理组4个重复，筛选出效果最佳的蛋白酶，作为后续试验用酶。

（2）最适加酶量筛选。试验设置1%，2%，3%，4%，5%，6% 6个加酶量处理。6组4%鱼蛋白液，置于温度55 ℃，超声波功率120 W的超声波清洗机中，分别按6个加酶量加入（1）中筛选出的最佳蛋白酶，充分酶解1 h，灭酶、抽滤、定容，取样测定，每个处理组4个重复，筛选出最适加酶量，作为后续试验加酶量。

（3）最适底物浓度筛选。分别配制为1%，2%，3%，4%，5%，6%6个底物浓度的鲭鱼鱼蛋白液，将6组样液置于超声波功率120 W，温度55 ℃的超声波清洗机中，按照（2）中的最适加酶量添加（1）中的最佳蛋白酶，每个处理组4个重复，反应1 h，灭酶、抽滤、定容，取样测定。

（4）最适酶解温度筛选。设置40，45，50，55，

60，65 ℃ 6个酶解温度处理。按最适底物浓度配制鲭鱼鱼蛋白液，将六组样液分别置于功率120 W的超声波清洗机中，分别按各处理温度控制温度，每个处理组4个重复，加入蛋白酶，反应1 h，灭酶、抽滤、定容，取样测定。

（5）最适超声波辅助酶解时间筛选。设置0.5，

1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h 6个酶解时间。按最适底物浓度配制鲭鱼鱼蛋白液，将6组样液置于功率120 W超声波清洗机中，控制最佳温度，加入蛋白酶，分别按6个酶解时间进行恒温超声波辅助酶解，每个处理组4个重复，酶解后进行灭酶、抽滤、定容，取样测定。

1.3.3 酶解制备工艺正交试验 通过对单因素结果分析，筛选出3个主要影响因素：底物浓度、温度和加酶量开展正交试验，使用L9（33）确定鲭鱼蛋白酶解的最佳酶解工艺[9]（表1）。

1.3.4 酶解液的肽含量测定 （1）双缩脲试剂。 取3.0 g硫酸铜和9.0 g酒石酸钾钠C4O6H4KNa·4H2O溶于500 mL蒸馏水中，搅拌加入300 mL 10%的NaOH溶液，用蒸馏水定容至1 000 mL，储存（如果存储时间过久溶液底部有黑色的沉淀产生需要重新配置[6]）。

（2）标准曲线的制作。准确称取0.1 g的牛血清蛋白BSA，加入适量蒸馏水溶解，多次洗涤后，将溶液及其洗涤液转入100 mL容量瓶中，定容至100 mL。取6支试管分别移取0，0.2，0.4，0.6， 0.8，1.0 mL的1 mg·mL-1的牛血清蛋白溶液，并补水至1 mL，摇匀后再在各个试管中加入4 mL双缩脲试剂，混匀后室温静置30 min，4 000 r·min-1离心10 min后用玻璃比色皿在可见分光光度计上测定各个样品在540 nm波长下的吸光度，以蛋白质质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，制作标准曲线。

（3）酶解液的抗氧化能力测定（DPPH自由基清除率的测定）[7] 。准确移取2 mL定容后的样液与2 mL（0.15 mmol·L-1）DDPH（使用无水乙醇准确配置），混合均匀，室温下避光反应30 min，置于离心机中4 000 r·min-1离心10 min，于517 nm处测吸光值为Ai，同时用同样的方法测定2 mL蒸馏水与0.15 mmol·L-1的DPPH 2 mL的吸光度，记为吸光度A0，以及2 mL样品溶液与2 mL无水乙醇混合液的吸光度为Aj。

DPPH自由基清除率（P）按如下公式计算[8]。

P= ×100% （1）

分析各种试样的DPPH清除率并做出曲线图。

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Excel和ChemExcel1.0软件进行数据处理和作图、结果分析。

2 结果与分析

2.1 酶解法制备鲭鱼抗氧化肽单因素试验结果分析

2.1.1 最适蛋白酶筛选 由图1、图2可知，鲭鱼蛋白可被不同的蛋白酶酶解，酶解液中存在的活性肽大多具备一定的抗氧化性，但在其他条件均相同的情况下，蛋白酶种类不同，所得多肽含量也不同，多肽对DPPH自由基的清除率也不同，其中以中性蛋白酶作为酶解用酶，所得到的活性肽含量及其对DPPH自由基的清除率显著高于其他3种蛋白酶，故选择中性蛋白酶为后续试验用酶。

2.1.2 最适加酶量筛选 由图3、图4可知，随着加酶量的增加，鲭鱼蛋白酶解液的多肽含量和DPPH清除率呈现先增加后降低的趋势，其中在加酶量為3%时达到峰值，多肽含量为13.15 mg·mL-1，DPPH的清除率为83.75%。

2.1.3 最适底物浓度筛选 由图5可知，随着底物浓度的增加，酶解获得的肽含量平缓增加，但差异不显著，至底物浓度4%时，肽含量达到一定峰值，随后有所下降。这可能是由于底物浓度低时，酶用量一定的情况下，与酶接触的底物越多，被酶作用后转变为肽的量就越多；当达到一定程度后，酶的量起到限制作用，所以肽含量不再增加。由图6可知，底物浓度1%时，酶解后所得多肽对DPPH清除率显著低于其他处理，其他处理间差异不显著，说明在底物浓度>2%后，底物浓度的增加没有明显提高DPPH清除率，超过4%时，甚至有一定程度的降低，这可能是由于底物浓度过高，在加酶量一定的情况下，酶解受加酶量的制约，因此，肽含量和DPPH清除率均下降。综合得出，最佳的底物浓度为4%。

2.1.4 酶解温度筛选 从图7、图8可以看出，在温度40～50 ℃时，多肽含量以及DPPH清除率随着酶解温度的增加而增加，在温度为50 ℃时，多肽含量以及DPPH清除率均达到最大值；温度超过50 ℃之后，DPPH清除率以及肽的含量呈现出下降的趋势，这是由于温度增高，超过了酶解的最适温度，导致酶解速率降低，抗氧化肽生成减少。由此可知，超声波酶解最适温度为50 ℃左右。

2.1.5 酶解时间的筛选 由图9，10可知，随着酶解时间的增加，肽含量和DPPH清除率增加，在酶解时间2.5 h时效果最佳；之后随着酶解时间的增加，多肽含量和DPPH清除率有下降趋势，可能由于酶解时间过长，抗氧化肽缓慢被酶解成氨基酸，因此，超声波酶解时间过短或过长均会对酶解产生不利影响，最佳的酶解时间控制在2.5 h左右比较合适。

2.2 正交優化鲭鱼抗氧化肽的制备试验结果分析

结合单因素试验，选择底物浓度、酶解温度和加酶量3个因素开展正交试验，对酶解制备抗氧化肽的条件进行优化[10]，结果详见表2。

从表2可以看出，经R值分析排列各类因素影响DPPH清除率以及活性抗氧化肽的主次顺序为：加酶量>酶解温度>底物浓度，通过表格K值分析得出最佳的实验因素组合为A2B2C2，即为加酶量3%，酶解温度50 ℃，底物浓度4%。

根据正交试验筛选的最佳试验因素组合，进行3次重复的验证试验[11]，得出DPPH清除率平均值为89.33%，高于单因素各项试验结果，从而验证得出，A2B2C2为最佳的鲭鱼抗氧化肽酶解制取工艺。

3 结 论

利用蛋白酶酶解鲭鱼蛋白制备抗氧化多肽方法是可行的，以肽含量和多肽对DPPH自由基的清除率为指标，结合单因素和正交优化试验筛选最佳制备工艺的条件为：酶解温度50 ℃、底物浓度4%、中性蛋白酶加酶量3%，超声波辅助酶解时间2.5 h，在此条件下，得到的多肽抗氧化能力较强， DPPH自由基的清除率达到89.33%。

目前，蛋白质酶解法是制备抗氧化肽的最佳工艺，其操作简洁，准确高效，鲭鱼的进一步开发利用可考虑酶解制备多肽这一路线，这为鲭鱼的深加工以及相关食品开发提供了参考和依据。

参考文献：

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