小麦细胞周期蛋白基因CDC25的原核表达及蛋白纯化

于宝佳　胡艳萍　刘彦妮　李开心　王华忠

摘 要：细胞分裂周期蛋白CDC25是一类苏氨酸/酪氨酸双特异性的磷酸酶，在动物上通过激活CDK进而推动细胞周期进程，然而植物CDC25的这一功能可能已经不重要或已被替代，故有关植物CDC25的功能还有待阐明。本研究构建了小麦CDC25基因TaCDC25.1-1AL的原核表达载体；导入大肠杆菌的TaCDC25.1-1AL基因能够被IPTG诱导表达，表达重组蛋白的表观分子量与理论分子量基本一致；利用Ni柱亲和层析方法获得了纯度较高的重组蛋白，为今后通过体外酶活分析、抗体制备和Western杂交等方法深入研究该蛋白和基因的功能奠定了基础。

关键词：细胞周期；小麦；CDC25；原核表达

中图分类号：S512.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.03.003

Abstract：Cell division cycle 25 （CDC25） is a dual-specificity threonine/tyrosine phosphatase， which， in animals， promotes cell cycle progression through activating cyclin-dependent kinases （CDKs）. However， the role of plant CDC25 in cell cycle regulation may be nonessential or has been replaced by other factors. Therefore， the function of plant CDC25 remains to be elucidated. In this study， a prokaryotic expression vector for the wheat CDC25 gene TaCDC25.1-1AL was constructed and transformed into E. coli. Results from SDS-PAGE showed that TaCDC25.1-1AL could express efficiently in E. coli through IPTG induction. The molecular weight of the recombinant protein is consistent with its predicted molecular weight. Recombinant proteins were further purified by the Ni-column affinity chromatography method. The obtaining of purified TaCDC25.1-1AL recombinant proteins laid a foundation for the future studies of in vitro enzyme activity， antibody preparation and western blot analysis on TaCDC25.1-1AL.

Key words： cell cycle； wheat （Triticum aestivum L.）； CDC25； prokaryotic expression

細胞分裂周期蛋白CDC25（Cell division cycle 25）是一类苏氨酸/酪氨酸双特异性的磷酸酶，属于络氨酸磷酸酶家族。酵母和动物上，Wee1和CDC25拮抗调控驱动细胞周期G2/M期转变的CDK激酶活性，Wee1激酶通过磷酸化作用负调控CDK活性，CDC25磷酸酶则同通过去磷酸化相同位置残基起正调控作用[1-3]。与动物不同的是，植物CDC25在细胞周期调控中的作用可能已经丧失。相关研究表明，拟南芥CDC25基因在快速生长的组织中不表现上调表达[4]；突变或过表达拟南芥CDC25不影响细胞周期长短和植株正常生长[5-6]。但是也有一些证据说明高等植物依然保留了CDC25-CDK这一调控通路，如拟南芥CDC25在酵母细胞中、酵母CDC25在烟草中过表达均表现细胞周期调控作用[4，7-9]；拟南芥CDC25突变体对羟基脲（一种DNA复制抑制剂）表现超敏感特征，说明CDC25可能参与了对G2/M期转变相关的DNA复制检验点的响应[5]。除尚不明确的细胞周期调控作用外，拟南芥、绒毛草、水稻和蜈蚣草等植物的CDC25还具有砷酸还原酶活性，作用于植物体内砷解毒的重要步骤——五价砷到三价砷的还原[6，10-14]。

目前高等植物CDC25研究主要集中在拟南芥、水稻等模式物种上，在重要农作物小麦上的相关研究还未见报道。本研究在前期克隆小麦CDC25基因TaCDC25.1-1AL的基础上，构建了该基因的原核表达载体，经大肠杆菌诱导表达和重组蛋白纯化过程获得了小麦TaCDC25.1-1AL的纯化重组蛋白，为下一步体外酶活测定、抗体制备和Western杂交等实验奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 基因和载体

小麦CDC25基因TaCDC25.1-1AL的全长cDNA由本实验室克隆于pLB-C25.1A载体上。原核表达载体pET30a由本实验室保存。

1.2 原核表达载体的构建

设计合成用于扩增TaCDC25.1-1AL基因完整ORF的引物对C25.1-F（GGGGTACCAT GGCGCGAAGCGTGTCGTA）/C25.1-R（CGGGATCCTCAAGAGCATGTGCCTTTGC），扩增产物两端带上KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点。使用该引物对和高保真pfu DNA聚合酶，以pLB-C25.1A质粒为模板进行PCR扩增。扩增产物和pET30a质粒经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切后进行连接。连接产物转化大肠杆菌后，使用菌落PCR和酶切方法鉴定重组克隆，鉴定到的重组表达载体经测序进行进一步确认。采用热激法将表达载体导入到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中。

1.3 原核表达

接种携带表达载体质粒的大肠杆菌BL21（DE3）到2 mL含50·mg L-1卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃ 振荡培养过夜。按1% 的比例扩大到10 mL 相同的液体培养基中，37 ℃ 振荡培养至对数生长期（3 h左右）。加入终浓度为0.5 mmol·L-1的IPTG，于28 ℃ 条件下震荡培养诱导目标基因的表达。分别于诱导后0，2，4，6，8 h取1 mL菌液用于总蛋白的SDS-PAGE电泳分析。

1.4 SDS-PAGE电泳

将1 mL菌液于10 000 rpm离心10 min，沉淀加入80 μL的ddH2O重悬，再加入20 μL的5X蛋白电泳上样缓冲液并混匀，沸水浴10 min。裂解的细胞于12 000 rpm离心5 min，取20 μL上清上样进行SDS-PAGE电泳（13% 分离胶，4% 浓缩胶）。电泳后用考马斯亮藍R-250染色液染色1 h，脱色液脱色至背景无色后观察并拍照。

1.5 重组蛋白的纯化

重组蛋白N端含组氨酸标签His（6），因此使用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒（康为世纪）在非变性条件下纯化重组蛋白。层析柱平衡、菌体超声波破碎、可溶性蛋白上样及杂蛋白清洗等过程参照试剂盒手册进行。分别使用3 mL含50，100，200，300，500 mmol·L-1 咪唑的洗脱液分段洗脱目标蛋白。收集各阶段的洗脱液进行SDS-PAGE（13% 分离胶，4% 浓缩胶）电泳和考马斯亮蓝R-250染色、脱色。纯化的蛋白质洗脱液于-80 ℃冰箱保存。

2 结果与分析

2.1 小麦TaCDC25.1-1AL基因原核表达载体的构建

通过PCR扩增获得了TaCDC25.1-1AL基因400 bp的完整ORF片段（图1），扩增片段两端带上了引物所含有的KpnⅠ（起始密码一端）和BamHⅠ（终止密码一端）识别位点。对扩增片段和pET30a载体质粒进行KpnⅠ和BamHⅠ双酶切，电泳结果表明载体质粒被正确地切成线状结构，也间接表明扩增片段两端得到正确酶切（图2）。将酶切后的片段和载体进行连接并进行大肠杆菌转化，随机挑取转化后培养基上长出的菌落作为模板，使用扩增TaCDC25.1-1AL基因ORF的引物对C25.1-F/C25.1-R进行菌落PCR扩增，结果表明挑取的4个菌落均能够正确扩增出400 bp的插入基因片段（图3）。选择1个菌落PCR扩增阳性的克隆进行质粒提取和KpnⅠ、BamHⅠ双酶切，结果插入基因片段能够正确地从重组载体上切出（图4）。重组载体经测序得到进一步确认，表明TaCDC25.1-1AL原核表达载体构建成功，并将其命名为pET-TaC25.1A。

2.2 小麦TaCDC25.1-1AL基因的原核表达

将原核表达载体pET-TaC25.1A导入大肠杆菌BL21（DE3）后，将大肠杆菌在28 ℃、添加0.5 mmol·L-1 IPTG的LB培养基中震荡培养，诱导目的基因TaCDC25.1-1AL的表达。如图5的大肠杆菌总蛋白电泳结果所示，未经IPTG诱导的总蛋白中无目标重组蛋白条带，而经IPTG 诱导后的总蛋白中出现融合组氨酸标签的His（6）-TaCDC25.1-1AL重组蛋白条带，重组蛋白表观分子量与理论分子量（18.3 kDa）基本一致，其表达量在诱导后0～8 h时间段内随诱导时间的延长逐渐增加。

2.3 原核表达TaCDC25.1-1AL重组蛋白的纯化

使用Ni 柱亲和层析方法从经IPTG诱导8 h的大肠杆菌总可溶性蛋白中纯化His（6）-TaCDC25.1-1AL重组蛋白。如图6所示，总蛋白上样后的流穿液（泳道3）中几乎没有重组蛋白，说明重组蛋白挂柱情况良好；再经15倍柱体积含10 mmol·L-1 咪唑的溶液洗涤杂蛋白后（未上样电泳），使用50～500 mmol·L-1的梯度咪唑浓度洗脱液洗脱重组蛋白，电泳结果表明，300，500 mmol·L-1 咪唑浓度洗脱液中的重组蛋白纯度较高，可满足后续的酶活测定和抗体制备等试验要求。

3 结论与讨论

目前植物CDC25基因的功能尚不明确，其细胞周期调控角色已不重要或被替代，砷解毒功能也只在砷胁迫环境中起作用，而且也只是次要通路[3，15-16]。因此，有必要对CDC25在植物上存在的意义，以及在其他生物过程中的未知功能开展更深入的研究。体外酶活性和蛋白质性质分析以及基于抗体的蛋白质免疫学研究方法等都离不开目标基因产物蛋白的获得。本研究以小麦为研究对象，利用常规的PCR、酶切、连接和测序等方法构建了基于pET30a的小麦CDC25基因TaCDC25.1-1AL的原核表达载体；在大肠杆菌中，该载体上的TaCDC25.1-1AL基因能够被IPTG诱导表达，产生的重组蛋白携带His（6）标签，分子量与理论值基本一致；通过Ni柱亲和层析过程中的梯度咪唑浓度洗脱液洗脱，在300～500 mmol·L-1咪唑浓度洗脱液中获得了纯度较高的TaCDC25.1-1AL重组蛋白。鉴于拟南芥和水稻的CDC25都具有体外的磷酸酶活性和砷酸还原酶活性[10，14，17]，小麦TaCDC25.1-1AL重组蛋白的获得为今后对其进行体外酶学分析奠定了基础，亦可作为抗原用于抗体制备，继而应用于小麦CDC25功能研究的免疫学方法中。

参考文献：

[1]DUNPHY W G， KUMAGAI A. The cdc25 protein contains an intrinsic phosphatase activity [J]. Cell， 1991， 67： 189-196.

[2]KUMAGAI A， DUNPHY W G. The cdc25 protein controls tyrosine dephosphorylation of the cdc2 protein in a cell-free system [J]. Cell， 1991， 64： 903-914.

[3]FRANCIS D. A commentary on the G2/M transition of the plant cell cycle [J]. Ann bot， 2011， 107： 1065-1070.

[4]SORRELL D A， CHRIMES D， Dickinson J R， et al. The Arabidopsis CDC25 induces a short cell length when overexpressed in fission yeast： evidence for cell cycle function[J]. New phytol， 2005， 165： 425-428.

[5]SPADAFORA N D， DOONAN J H， HERBERT R J， et al. Arabidopsis T-DNA insertional lines for CDC25 are hypersensitive to hydroxyurea but not to zeocin or salt stress[J]. Ann bot， 2011， 107： 1183-1192.

[6]DISSMEYER N， WEIMER A K， PUSCH S， et al. Control of cell proliferation， organ growth， and DNA damage response operate independently of dephosphorylation of the Arabidopsis CDK1 homolog CDKA；1 [J]. Plant cell， 2009， 21： 3641-3654.

[7]ORCHARD C B， SICILIANO I， SORRELL D A， et al. Tobacco BY-2 cells expressing fission yeast cdc25 bypass a G2/M block on the cell cycle [J]. Plant J， 2005， 44： 290-299.

[8]BELL M H， HALFORD N G， ORMROD J C， et al. Tobacco plants transformed with cdc25， a mitotic inducer gene from fission yeast [J]. Plant mol biol， 1993， 23： 445-451.

[9]MCKIBBIN R S， HALFORD N G， FRANCIS D. Expression of fission yeast cdc25 alters the frequency of lateral root formation in transgenic tobacco[J]. Plant mol biol， 1998， 36： 601-612.

[10]ELLIS D R， GUMAELIUS L， INDRIOLO E， et al. A novel arsenate reductase from the arsenic hyperaccumulating fern Pteris vittata [J]. Plant physiol， 2006， 141： 1544-1554.

[11]CESARO P， CATTANEO C， BONA E， et al. The arsenic hyperaccumulating Pteris vittata expresses two arsenate reductases [J]. Sci rep， 2015， 5： 14525.

[12]DUAN G L， ZHU Y G， TONG Y P， et al. Characterization of arsenate reductase in the extract of roots and fronds of Chinese brake fern， an arsenic hyperaccumulator [J]. Plant physiol， 2005， 138： 461-469.

[13]BLEEKER P M， HAKVOORT H W， BLIEK M， et al. Enhanced arsenate reduction by a CDC25-like tyrosine phosphatase explains increased phytochelatin accumulation in arsenate-tolerant Holcus lanatus [J]. Plant J， 2006， 45： 917-929.

[14]DUAN G L， ZHOU Y， TONG Y P， et al. A CDC25 homologue from rice functions as an arsenate reductase[J]. New phytol， 2007， 174： 311-321.

[15]SANCHEZ-BERMEJO E， CASTRILLO G， DEL LIANO B， et al. Natural variation in arsenate tolerance identifies an arsenate reductase in Arabidopsis thaliana[J]. Nat commun， 2014， 5： 4617.

[16]CHAO D Y， CHEN Y， CHEN J， et al. Genome-wide association mapping identifies a new arsenate reductase enzyme critical for limiting arsenic accumulation in plants[J]. PLoS biol， 2014， 12： e1002009.

[17]LANDRIEU I， DA C M， De V L， et al. A small CDC25 dual-specificity tyrosine-phos- phatase isoform in Arabidopsis thaliana[J]. Proc natl acad sci USA， 2004， 101： 13380-13385.