CRISPR/Cas9系统的脱靶效应及其介导的非编码RNA编辑在人类癌症中的应用

吴家栋 综述，肖 瑞 审校

(内蒙古医科大学分子病理学重点实验室，呼和浩特 050059)

成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR蛋白9(Cas9)是一种多功能的基因组编辑技术，被称为分子剪刀，广泛应用于遗传因子功能的研究、遗传疾病的临床前研究、癌症研究、药物发现、精神疾病研究及植物应用等领域。CRISPR/Cas9系统被发现于多种细菌和古细菌物种中，已经成功地被用于编辑真核生物基因组[1-2]。目前，越来越多的数据表明CRISPR/Cas9系统不仅可以靶向蛋白质编码基因组，而且可以靶向人类的非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)[3-5]。然而，CRISPR/Cas9系统也有其局限性，它存在严重的脱靶效应，这可能导致基因组不稳定性并破坏其他正常基因的功能[6-7]。癌症是导致人类死亡的主要原因之一[8]，尽管肿瘤的综合治疗已取得了令人振奋的成果，但是肿瘤的复发及放化疗过程中出现的不良反应等问题大大降低了癌症患者的生活质量[9]，而CRISPR/Cas9系统可以纠正导致癌症的突变，并且是一种可以在基因水平保护患者的治疗技术[3]，因此，CRISPR/Cas9系统的出现拉开了癌症治疗的新序幕。本文通过总结CRISPR/Cas9系统的脱靶效应及其在ncRNA相关基因组编辑中的最新应用，旨在为肿瘤治疗的深入研究甚至临床治疗提供新思路。

1 CRISPR/Cas9系统的概述

迄今为止，已经开发了3种可编程核酸酶用于基因组编辑，包括锌指核酸酶(ZFN)[10]，转录激活剂样效应子因子核酸酶(TALEN)[11-12]和CRISPR相关蛋白(Cas)系统[13]的RNA引导的核酸酶(RGNs)。在这些核酸酶中，根据其指导RNA和DNA之间的Watson-Crick碱基配对识别目标DNA的Cas9核酸酶实施最简单，并且迅速成为基因组工程中最流行和有力的工具。CRISPR/Cas9系统是来自细菌和古细菌的适应性免疫系统，可检测和降解来自噬菌体和质粒的侵染性DNA[14]。1987年末，ISHINO等[15]在大肠杆菌中首次发现了聚类重复片段被一系列间隔序列中断，该现象后被称为CRISPR。到目前为止，研究人员已经发现了10多种不同的CRISPR/Cas系统，根据其不同的机制将其分为3类(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)和许多亚型[16-17]。其中CRISPR/Cas9是一种在化脓链球菌中应用的Ⅱ型CRISPR系统，由于其具有高效率和高准确性，是哺乳动物中使用最广泛的系统[18]。Cas9介导的基因组编辑有3个要求：(1)单链向导RNA(single guide RNA，sgRNA)序列，CRISPR/Cas9系统是第一个用于基因组编辑的CRISPR/Cas系统，部分原因是它含有一个相关的易编程的sgRNA，只有20个核苷酸长的识别序列[1-2，19]。 sgRNA由具有与靶位点互补序列的CRISPR RNA(crRNA)和分别转录并部分与crRNA互补的反式激活的crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)组成[1，20-21]。(2)具有核定位信号的Cas9蛋白，为了发挥基因组编辑功能，CRISPR/Cas9系统还需要与这两种RNA组分紧密相关的关键酶组分Cas9核酸酶[18]，这些RNA需要将Cas9蛋白引导到靶位点并激活Cas9核酸酶。(3)前间区序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)，sgRNA与Cas9蛋白结合形成复合物，sgRNA与Cas9蛋白结合形成复合物，并严格识别位于靠近PAM的3′末端侧翼的靶向互补DNA序列，其通常由NGG或NAG(N可为A，T，G或C)组成，然后启动DNA双链断裂(DSBs)[9]。从理论上讲，带有PAM的任何基因组序列都可以由Cas9用特定的sgRNA进行编辑，由于基因组中PAM的高发生率，CRISPR/Cas9系统中的sgRNA几乎可以靶向所有的基因。

2 CRISPR/Cas9系统的脱靶效应

虽然CRISPR/Cas9系统与ZFN、TALEN等其他的基因组编辑技术相比有许多优势，但它仍有一些严重的缺点亟待解决，例如脱靶效应，也就是说Cas9可能会错误地结合到目标位点之外的序列内并产生突变，引起一些严重的后果[5，22-23]。SCHAEFER等[24]采用全基因组测序检测经CRISPR处理的小鼠细胞的脱靶情况，结果显示，在经CRISPR/Cas9体内编辑后诱导出高数目的突变，该研究表明CRISPR/Cas9系统的脱靶效应是一个广泛存在的现象。这种脱靶效应已经通过不同的体内和体外方法进行了彻底分析[8-9，25]，主要是由于sgRNA的识别序列与非靶点DNA发生了局部匹配，主要原因有：(1)一般情况下，sgRNA不能识别和编辑任何邻近PAM的非靶点DNA位点(长度为10～12 bp)，发生碱基错配，且不能识别3个以上的非靶点DNA位点。经典的通过体外筛选结合高通量测序的方法检测CRISPR/Cas9系统在HEK293T细胞的脱靶情况的研究表明，Cas9的sgRNA有多达5个错配[25]。(2)当脱靶位点DNA序列长度比sgRNA多或少几个碱基时会形成DNA凸起或RNA凸起，从而完成其他碱基的正确配对。即使脱靶位点DNA序列长度比sgRNA的识别序列的长度差5 bp，仍能通过形成多个凸起的形式进行碱基配对并介导CRISPR/Cas9系统进行DNA切割[26]。

2.1CRISPR/Cas9系统脱靶效应的影响因素

2.1.1sgRNA 虽然Cas9的靶点特异性地被sgRNA的20nt引导的序列区严格控制着，但几项初步研究表明，sgRNA邻近PAM的10～12 bp的碱基配对更能决定Cas9的靶点特异性，并且通常比其余的向导RNA(gRNA)序列更重要[2，18]。此外，sgRNA的GC含量也与特异性密切相关。在一项CRISPR/Cas9介导诱变的研究中观察到，sgRNAs的PAM序列的最近端区域其诱变效率与GC含量呈正相关[27]。研究表明，在最接近PAM序列的6个碱基对的序列中，具有至少4个GC的sgRNA具有超过60%的可遗传突变率，这提示可以根据PAM附近序列的GC含量选择有效的sgRNA。

2.1.2PAM CRISPR/Cas9系统进行切割的必要条件就是PAM序列区，也就是说即使靶点序列与sgRNA序列完全匹配，如果没有PAM序列，Cas9也不能进行切割[28]，而DNA的切割效率也取决于PAM序列[29]。NGG(N可为A，T，C或G)是PAM的既定序列。然而，最近的研究表明，尽管与NGG相比只有约五分之一的结合效率，Ⅱ型CRISPR系统也可以使用NRG(其中R为G或A)作为PAM序列。几项研究报道，NRG序列是人EMX基因座中CRISPR/Cas9介导的DNA切割的主要非既定PAM[9，30]。PAM序列中每个碱基的结合频率不同。第1个核苷酸是最不固定的，其中G在接近50%的结合位点，而第2个位置，G在大于90%的结合位点[9，31]，表明NRG不是CRISPR/Cas9序列设计的最佳PAM。因此，NRG PAM序列对Cas9 DNA切割的确切作用在很大程度上尚不清楚[32]。

2.1.3Cas9蛋白和其他因素 研究显示，将纯化的Cas9蛋白和sgRNA直接输送到细胞中，可导致脱靶效应降低，这是因为Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物在分娩后几乎立即切割染色体DNA并在细胞中迅速降解[33-34]。脱靶效应还可能与细胞型特异性有关，并且高度取决于特定细胞类型的DNA双链断裂(DBS)修复途径的完整性[35]。此外，CpG位点的DNA甲基化也可能会阻碍Cas9在细胞中的结合效率[36]。

2.2降低脱靶效应的策略

2.2.1改变sgRNA序列 通过截短sgRNA的3′末端、缩短与sgRNA的5′末端的靶点互补区域3nt或添加2个鸟嘌呤核苷酸到sgRNA的5′末端，可以大大降低脱靶反应，并可在一些脱靶位点减少约5 000倍突变的可能[25，37]。同时，RNA引导的内切核酸酶(RNA-guided endonuclease，RGEN)使用这些改变的sgRNA也可以降低脱靶效应。

2.2.2控制Cas9/sgRNA复合物的浓度 如果增加转染的DNA量，则增加了Cas9/sgRNA复合物的浓度，虽然增加了正确靶点的结合率，但也增加了脱靶效应；如果减少转染的DNA的量，则减少了Cas9/sgRNA复合物的浓度，通过增加靶点专一性导致靶内切割减少，即脱靶效应减少，但正确靶点的结合率也随之降低[38]。因此，必须考虑靶内切割效率和脱靶效应之间的平衡。所以未来对Cas9和sgRNA的优化设计需要考虑在提高Cas9特异性的同时而不牺牲靶内切割效率[9，25，39]。

2.2.3应用双切口措施 尽管可以设计高度特异性的sgRNA，但是Cas9的脱靶活性却降低了其靶向位点的数量，为了克服这个缺陷，有研究者将Cas9蛋白修饰得到其突变型D10ACas9切口酶(Cas9n)，Cas9n替换野生型Cas9蛋白[40-41]。这些Cas9n需要一对sgRNA编辑1个位点，由于Cas9n只有1个结构域，只能通过切割DNA单链产生1个切口，因此Cas9n会在每个sgRNA结合的位置形成单链切口，两个相邻的单链切口会引起DBS，DBS形成后细胞会进行修复。而在脱靶位点处，单链切口则无法形成DBS。因此，该方法在保持基因切割效率的同时，具有最小程度的脱靶效应。目前，该方法已经被其他许多实验室广泛应用[39-40，42]。

2.2.4fCas9系统 为了进一步提高DNA的切割特异性，研究者已经合成了具有FokI核酸酶结构域(fCas9)的无催化活性的Cas9(dCas9)的融合物(FokI-dCas9)，FokI-dCas9编辑目标DNA位点的特异性比野生型Cas9高140倍以上[43-44]。fCas9系统要求当两个FokI-dCas9彼此靠近形成二聚体时才可进行DNA切割。该方法在很大程度上降低了非靶向位点的DNA切割[44]。

3 CRISPR/Cas9系统介导的ncRNA编辑在人类癌症中的应用

3.1CRISPR/Cas9系统中的微RNA(miRNA)编辑 目前，许多研究已经表明CRISPR/Cas9系统是ncRNA相关基因组编辑或调控的最佳选择[45-52]。miRNA作为主要的ncRNA之一在CRISPR/Cas9相关领域已被广泛研究。CHANG等[45]证明了CRISPR/Cas9系统在初级miRNA结构上产生的改变可导致成熟的miRNA在体内和体外下调，同时，这项研究还表明正确设计CRISPR/Cas9中sgRNA可显著将同一家族中具有高度保守序列的miRNA的脱靶效应最小化。ZHOU等[53]的研究中利用CRISPR/Cas9系统成功敲除了肝癌细胞系中的miRNA-3188，发现miRNA-3188 KO能有效地抑制细胞生长、侵袭和迁移，并抑制裸鼠中的异种移植物肿瘤生长。另一项研究表明，慢病毒CRISPR/Cas9载体在将插入和缺失引入前体miRNA序列中是高效的，通过使用该方法研究者成功地破坏了miRNA-21的表达，并发现前体miRNA-21序列的破坏可导致卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭的减少。除了编辑或调节上述的miRNA之外，CRISPR/Cas9系统在各种癌细胞或生物体中也显示出对其他miRNA如miRNA-137、miRNA-93、miRNA-309、miRNA-126a/b等的广泛应用[47-51]。

3.2CRISPR/Cas9系统中的长链非编码RNA(IncRNA)编辑 除了miRNA之外，另一种主要调控多种生物学过程的ncRNA，即IncRNA已经被CRISPR/Cas9系统成功调控。尿路上皮癌抗原1(UCA1)是膀胱癌中上调的IncRNA，可以通过特定设计的CRISPR/Cas9的gRNA来靶向，并在体内和体外有效地被抑制[54]。可见，CRISPR/Cas9系统可调节IncRNA的表达，并可为临床治疗癌症提供新方法。微小的基因的缺失或插入可能不一定使某个非编码基因的功能丧失，这可能是将CRISPR/Cas9系统应用于非编码基因的限制之一。为了克服这个障碍，HO等[55]采用同源重组技术，将标记基因整合到基因组中，通过CRISPR/Cas9系统成功地将UCA1、IncRNA-21及AK023948分别在HTC-116和MCF-7细胞中敲除。在SHECHNER等[56]的研究中，研究者开发了CRISPR-Display(CRISP-Disp)法，一种使用Cas9将大分子RNA载体部署到DNA基因座的有目标性的定位方法，研究者发现至少长4.8 bp的功能性RNA结构域可以插入CRISPR gRNA的多个位点中，从而允许构建具有天然lncRNA的Cas9复合物，这种方法可能为癌症领域中的IncRNA研究开辟一条途径。

4 小 结

目前CRISPR/Cas9系统作为第3代基因编辑技术，由于其经济、易操作，研究者们可以在其工作包中通过获得更好的选择而轻松地编辑感兴趣的基因组等优点已成为科学界的研究热点。虽然CRISPR/Cas9系统的优势不言而喻，但它仍面临着许多问题与挑战。

CRISPR/Cas9系统的脱靶效应可能会是造成不良遗传改变的原因，从而导致癌症或其他棘手的问题，成为CRISPR/Cas9系统的瓶颈。虽然研究者们已经投入了很多努力改进对脱靶效应的预测和降低脱靶效应，但为了能更精确有效地编辑目标序列，需要研究者们开发更多的技术和算法。以往地研究认为，脱靶效应是一个不常见的现象，然而SCHAEFER等[24]的研究表明脱靶效应是广泛存在的，尽管这个观点对以往的结论提出了挑战，但这不是CRISPR/Cas9系统的危机，相反，这是研究者在使用新技术时检测脱靶效应的助力。

伦理问题是研究者在实际应用CRISPR/Cas9相关技术之前无法避免的问题。迄今为止，大多数国家都允许研究者编辑基因组，用于提高粮食产量其他生物用途。然而，关于操纵人类的卵子和精子等仍然非常具有争议。首先，CRISPR/Cas9技术仍是一个尚不成熟的基因编辑技术，遗传改造对后代的长期影响知之甚少，一旦发生错误或脱靶效应，将导致严重的后果。其次，CRISPR/Cas9技术可以编辑想要的任何基因组，如果将CRISPR/Cas9技术应用于反进化和反人类，将会带来巨大的社会冲突。尽管存在分歧，但笔者乐观地认为，研究者将会就这个问题与伦理学家和法律达成共识。

尽管CRISPR/Cas9系统仍然存在各种各样的局限性和障碍，但相信将来随着技术的逐渐成熟，能够有助于药物发现、癌症治疗及基因疾病的治愈。

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