血友病治疗新进展*

杨凌霄 综述，陈 姝 审校

(重庆医科大学附属第二医院血液科 400010)

血友病是一种罕见的X染色体连锁隐性遗传的一组出血性疾病，分为血友病A(FⅧ缺乏)和血友病B(FⅨ缺乏)，男性发病，女性常为致病基因携带者。血友病患者常以关节、深部肌肉为主要出血部位，大约70%～80%患者因关节长期出血而并发血友病性关节炎[1]。目前，以血源性凝血因子和重组凝血因子为主的替代治疗仍是血友病最主要的治疗方式。近十余年来，血友病的治疗取得了许多新进展，主要包括4个方面：传统的按需治疗模式转向更为理想的预防治疗模式，对抑制物的预防与治疗，长半衰期因子等新药的研制，以及基因治疗的研究。

1 预防治疗

近年来，按需治疗的不足之处逐渐显现。当出血发生，按需治疗虽能尽快做到止血、控制疼痛，但关节、肌肉的损害是不可逆的，形成了反复出血和慢性血友病性关节炎的恶性循环。预防治疗在20世纪70年代最早由瑞典的Nilsson等提出，1994 年被WFH 和 WHO 推荐为重度儿童血友病的治疗策略[2]。预防治疗是指尝试定期预防性替代输注凝血因子，使重型患者体内凝血因子(FⅧ:C/FⅨ:C)含量长期维持在1%(0.01 U/mL)以上，以防止或减少出血的发生。

根据预防治疗因子使用剂量的不同，有3种治疗方案[3]：大剂量方案(每次25～40 IU/kg，血友病A每周给药3次，血友病B每周给药2次)；中剂量方案(每次15～30 IU/kg，血友病A每周给药3次，血友病B每周给药2次)；低剂量方案是对于包括我国在内的资源有限的发展中国家一种有效的过渡性方案，基于中国现状和短期临床数据，中国血友病协作组、预防治疗工作组和儿童工作组推荐血友病A 10 IU/kg,每周2次和血友病B 20 IU/kg,每周1次的低剂量预防治疗计划。

预防治疗可以减轻疼痛，减少出血次数，预防危及生命的大出血发生，降低日后关节外科手术的可能性，尽可能避免残疾的发生。但预防治疗仍存在一些不可忽视的弊端，由于目前常用的血源性或重组的FⅧ、FⅨ其半衰期较短，导致了用药频率高，患者顺应性差。此外，持续使用凝血因子、抑制物产生的风险增加，抑制物阳性的患者费用负担更重。血友病的治疗虽然还存在诸多不足，但预防治疗的推进和普及依然是血友病治疗的根本。

2 抑制物的处理

近年来，重组FⅧ制剂、重组Ⅸ制剂，保证了产品的安全性，控制了血源感染的风险。但是，血友病患者长期输注凝血因子带来了另一严重并发症，即FⅧ、FⅨ抑制物产生。抑制物产生后增加了出血的程度和频率，加大了治疗的难度和费用，增加了残疾率和病死率，进而严重影响了患者的生存质量。

抑制物形成的危险因素有遗传和非遗传因素。基因大片段缺失、22号染色体倒位、无义突变、种族问题、T细胞亚群、MHC-Ⅰ/Ⅱ表型、免疫调节基因多态性等均是遗传的高危因素。此外，还包括年龄、疾病严重程度、凝血因子产品类型、用药方案、首次治疗时间、创伤和手术等非遗传因素[4-5]。当患者对常规替代治疗无效时，需警惕抑制物产生。

一些遗传方面的危险因素提示存在抑制物家族史是一个强有力的预测指标[5-6]，因此在开始替代治疗前，开展抑制物的遗传风险评估是非常有价值的，但是环境因素的影响及免疫系统的复杂性给评估带来了困难。因此需要找到一种新的手段，能够代替常规的因子替代治疗，从而达到预防的目的。

免疫耐受疗法(immune tolerance induction，ITI)是针对抑制物的一个主要治疗方式。ITI即重复给予FⅧ使患者产生免疫诱导，体内产生特异性抗体中和抑制物。有资料显示，该疗法对血友病A患者的成功率为60%～80%，但对血友病B患者的影响却较少，仅25%成功[7-8]。ITI用于抑制物阳性的血友病患者，是公认的去除抑制物的主要手段，此外，ITI还可用于即将接受替代治疗的患者，减少抑制物的产生。但目前仍需对照研究来决定ITI的方案[9]。ITI治疗失败的患者，需要考虑使用免疫抑制剂治疗。目前正在使用的免疫抑制剂包括：利妥昔单抗、霉酚酸酯、地塞米松和丙种球蛋白。一些病例报道单用利妥昔单抗治疗抑制物疗效显著[10]，但由于该药降低了B细胞数，仍需大量临床研究确定其安全性及带来的不良反应。

此外，还有旁路制剂疗法。激活的凝血酶原复合物(plasma derived activated prothrombin complex concentrate,pd-APCC)含有外源性或共同凝血途径中所需的FⅡa、FⅦa、FⅩa等，不通过内源性凝血途径以“旁路”的形势到达凝血终点。一个独立的前瞻性研究中观察到:使用FⅧ旁路途径抑制物(factor eight inhibitor bypass activity,FEIBA) 非连续性的每周给予3次药，每次给药85 U/kg，与按需治疗相比，可以将出血率降低62%[11]。将FEIBA以预防治疗的形式用于存在抑制物的血友病患者中，是安全、有效、可行的。

3 新型药品

3.1双特异性抗体(ACE910) 2015年9月，瑞士罗氏公司(Roche)开发了用于治疗甲型血友病的新抗体药物ACE910(emicizumab)。ACE910是一种重组人源化的双特异性单克隆抗体，对FⅨa和FⅩ具有高亲和力，通过双亲和作用发挥酶催化反应的辅因子作用，模拟凝血因子Ⅷa，使凝血因子Ⅸa催化凝血因子X形成凝血因子Ⅹa发挥止血作用。该抗体在受试者中具有良好的耐受性，Ⅰ、Ⅱ期研究显示，伴或不伴有抑制物的血友病A患者，其年出血率(annualized bleeding rates,ABR)均降低，尚无严重不良事件报道[12]。该药因皮下给药(每周1次)、半衰期长(4～5周)、免疫原性低、液体常温保存得到青睐。此外，除结合位点外，ACE910与FⅧ无类似结构，不会被FⅧ的抗体破坏，从而使许多抑制物阳性的血友病A患者受益。Ⅰ期临床研究显示，治疗效果对不同人种没有明显区别，1 mg/kg每周皮下注射1次emicizumab可以达到约10%正常水平凝血因子Ⅷ，能让中、重度血友病A缓解为轻度[13]。

3.2血友病旁路抗凝蛋白抑制剂

3.2.1拮抗组织因子途径抑制物TFPI(concizumab) 抗凝过程由抗凝血酶3(AT-3)、组织因子途径抑制物(TFPI)、蛋白C和蛋白S这4种血浆蛋白控制，TFPI是组织因子(TF)、FⅦ和FⅩ的抑制物，是一种在正常生理条件下血液中存在的天然抗凝物质。TFPI有3个不同功能的结构域，其中2个结构域分别与TF-FⅧ和FⅩa结合并发挥抑制作用，第3个结构域与具有抗凝作用的蛋白S结合，起协同作用，从而阻止凝血酶原转换为凝血酶，达到抗凝的效果。新型药物的另一个发展方向为TFPI抗体concizumab[14]。该抗体是一种人源化的具有高亲和力的单克隆抗体，能作用于TFPI的结构域，干扰TFPI和FⅩa形成复合物，从而抑制TFPI的活性。

3.2.2siRNA靶向沉默抗凝血酶(ALN-AT3) 2014年11月有研究报道了应用RNA干扰(RNAi)疗法的新药即ALN-AT3，该药皮下注射，有望将治疗频率减少至每周1次甚至每月1次，适用于伴或不伴抑制物的血友病A和B[15]。抗凝血酶(AT)主要为抗凝血酶3(AT3)，同样是一种在正常生理条件下血液中存在的天然抗凝物质，其通过灭活FⅩa和凝血酶达到抗凝作用。ALN-AT3通过一种基因沉默程序发挥作用，这一程序可以关闭AT的功能，通过抑制AT提升凝血酶水平和活性，从而在不补充外源性凝血因子的情况下，减少出血的次数。其在Ⅰ期试验中被用于中重度血友病患者，中期结果显示 ALN-AT3 能够使 AT 的活性降低 86%[15]。

3.3延长半衰期(extended half-life,EHL)的产品 在替代治疗中，因为FⅧ产品只有8～12 h的半衰期，目前被广泛使用的预防治疗方案也需要大约每周2～3次，甚至在某些情况下每天1次的重复静脉输注，这为治疗带来不便，也促使研究者们开发出半衰期延长的因子产品，从而减少静脉输注的频率，同时更长时间地避免患者出血。

3.3.1聚乙二醇分子(PEG)聚合化 PEG聚合化是将活化的PEG通过化学方法以共价键耦联到蛋白质或多肽分子上。PEG修饰后具有增强生物学、物理、化学稳定性，减少毒副作用，降低或消失免疫原性的作用。最重要的是，PEG聚合化后处于亲水状态，与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP1)结合，减少在肝脏内的清除，达到延长半衰期的作用，能将平均半衰期提高到原来的1.6倍左右[16]。2015年11月13日，美国FDA批准Baxalta公司生产的BAX855(Adynovate)用于成人和12岁及以上年龄的青少年血友病A患者，借助PEG技术，每周2次的预防治疗方案能使该药能在血液中维持较长的时间[17]，同类型的还有Bayer公司生产的BAY94-9027，Novo Nordisk公司生产的N8-GP。有报道显示PEG会残留在网状内皮系统，但目前暂没有证据提示残留PEG的长期毒性[18-19]。N9-GP(Rebinyn)是由Novo Nordisk公司研制的PEG聚合化的长效rFⅨ制剂，能将平均半衰期提高到原来的6倍，临床试验仍在进行中[20]。

3.3.2融合蛋白表达 融合蛋白法是延长rFⅧ和rFⅨ半衰期的另一个策略，包括清蛋白融合法和Fc片段(免疫球蛋白IgG恒定区)融合法。研究显示，将清蛋白与FⅨ融合后能将半衰期较传统rFⅨ延长至少5倍；将Fc片段与FⅧ融合后，凝血因子可避免被溶酶体降解，半衰期可延长1.6倍，但远低于Fc片段与FⅨ融合的效果，后者的半衰期可延长3.0～4.0倍[21-22]。

Biogen Idec公司生产的Efmoroctocog alfa (Eloctate) 是一种与Fc片段相融合的缺失B结构域的人FⅧ因子类似物，2014年由FDA批准用于血友病A儿童及成人患者的首个长效重组药物。该药每隔3～5天预防性输注，在控制和预防出血事件、围术期管理和常规预防等方面均优于常规药物[21]。该公司生产的另一种重组因子Ⅸ Fc融合蛋白疗法新药Alprolix(rFIX-Fc)，用于血友病B的治疗，适用于所有年龄段的B型血液病患者的按需治疗和预防性治疗。预防性用药时，可以每隔7或10天给药一次[22]。

4 基因治疗( gene therapy)

目前替代治疗是血友病患者的主要治疗方式，但由于血友病是单基因遗传病，因子活性水平的轻度变化即可改变疾病的表型，因此对于血友病，基因治疗是最理想的方式，也是根治血友病的唯一办法。基因治疗即是通过载体将正常的FⅧ和FⅨ基因转导入患者体内。载体可分为病毒载体和非病毒载体，常用的病毒载体包括逆转录病毒载体(RV)、腺病毒载体(AV)、腺相关病毒载体(AAV)，而治疗基因片段的大小影响载体的选择。FⅧ基因片段较大，逆转录病毒和腺病毒是其主要载体，腺相关病毒是FⅨ的主要载体。此外，一些致力于基因修正的新技术如定向性重组染色体DNA的锌指核酸酶技术(Zinc finger nuclease,ZFN)，高效基因编辑技术CRISPR/Cas9系统也在研究中[23]。

4.1腺相关病毒载体(adeno-associated virus，AAV) AAV是一种单链DNA细小病毒，无致病性、免疫原性，能够使外源基因在肌肉、肝脏、中枢神经系统长期持续稳定表达，因上述优势，AAV成为了基因治疗血友病B的重要载体，也是近年来血友病B基因治疗的研究热点。有试验显示，FⅨ严重缺乏者，经AAV转导FⅨ后，能将体内FⅨ水平维持在3%～7%[24]。但由于AAV只能容纳小于4 kb的基因片段，包装容量小，因此一般不作为血友病A基因治疗的载体。最近的研究通过对FⅧ的基因片段进行修饰，可以去除B结构域，优化密码子，且不影响其凝血功能，已经能使AAV“适配”FⅧ[25]。BioMarin公司生产的BMN270(AAV5)作为FⅧ的载体已进入Ⅰ期试验中。

4.2以细胞为基础的基因整合 慢病毒载体(Lentiviral vectors,LV)是以细胞为基础的另一种基因治疗手段，与AAV不同的是，它能够将目的基因整合到多种靶细胞的DNA中(如骨髓造血干细胞、肝窦内皮细胞、多能干细胞分化的内皮祖细胞)，具有目的基因表达时间长、不易出现免疫反应等优点。在幼鼠模型中，使用特异性启动子能够在血小板的α-颗粒内异位表达FⅧ，当血小板激活后，迅速释放FⅧ到出血部位，从而减少异基因抗体的发生[26]。

5 结 语

长久以来，替代治疗仍是血友病最主要的治疗方式，预防治疗是改善血友病生存质量的根本，血源凝血因子和重组凝血因子仍是替代治疗最主要的药物。近年来，基因治疗策略及新型药物如长效凝血因子、非因子替代治疗剂、抗凝血酶灭活剂等为血友病治疗带来了革新，特别是非因子替代治疗剂、抗凝血酶灭活剂、TFPI拮抗剂，这些产品将彻底改变抑制物阳性患者的治疗方式，并为没有抑制物的患者提供更方便的替代方案。以上药物用量比因子产品少，并且具有皮下给药而不是静脉内给药的优势，此外，由于暴露于外源性因子产物是抑制物的产生因素，这些新产品尽可能减少或消除因子的暴露，有助于预防抑制物的产生。基因诊治是现在最热门的方向，虽处在临床发展的早期阶段，但为血友病的治疗带来了无限潜力，但其存在的免疫原性、安全性等诸多问题仍需进一步研究解决。