HPLC法测定新面醑中甲硝唑、氯霉素、水杨酸含量

刘 徽，蔡 琳，廖海燕

新面醑为第三军医大学第二附属医院生产的医院制剂，临床主要用于治疗寻常痤疮及头皮脂溢性皮炎等，为常见的皮肤科用药。其主要有效成分为甲硝唑、氯霉素、水杨酸，原《总后卫生部非标准制剂标准》采用容量分析方法测定水杨酸的含量，却未对甲硝唑和氯霉素含量做具体规定。为了实现对该制剂质量的更好监控，通过查阅相关文献资料[1-6]，对甲硝唑和氯霉素含量测定方法，采用高效液相色谱（HPLC）法居多，笔者探讨了采用HPLC法同时检测甲硝唑、氯霉素、水杨酸含量的方法，供同仁参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪（岛津，日本），优普系列超纯水器（型号：UPT-Ⅰ，生产厂家：成都超纯科技有限公司），超声波清洗器（型号：KQ5200E，生产厂家：昆山市超声仪器有限公司），电子分析天平（型号：BT25S，生产厂家：赛多利斯）。

1.2 试药 甲硝唑对照品（中国食品药品检定研究院，纯度 99.9%，批号：100191-201507），氯霉素对照品（中国药品生物制品检定所，纯度99.4%，批号：130555-201203），水杨酸对照品（中国食品药品检定研究院，100106-201104，纯度：99.9%），甲醇（成都科龙化工试剂厂，批号：2013120401），磷酸（成都科龙化工试剂厂：批号：20130413），色谱甲醇（A455-4，飞世尔，美国），超纯水（自制），新面醑（第三军医大学第二附属医院生产，批号：170207、170219、170316）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液制备 取甲硝唑、氯霉素、水杨酸对照品适量，加流动相制成每1 ml分别含甲硝唑0.1mg、氯霉素0.1mg、水杨酸0.0125mg的溶液，混合后作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取新面醑2ml，置200ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.3 阴性对照溶液 按照处方，分别加入除甲硝唑、氯霉素和水杨酸以外的其他成分，制备阴性样品100ml，按照“2.1.2”制备方法制成阴性对照溶液。

2.2 色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱 Inertsustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -水（55∶45）（pH3.2），检测波长 230 nm；柱温 35℃，进样量：10 μl。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验 按照上述色谱条件进样对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10μl，3组分出峰顺序依次为甲硝唑、氯霉素、水杨酸（图1）。3组分保留时间分别为4.4、7.0、10.0min，分离度分别为1.8、3.2、3.9，分离度均符合规定。结果显示阴性对照溶液在主峰位置无色谱峰，专属性良好。

2.3.2 线性关系考察 采用上述方法分别进样对照品溶液各 2、4、8、10、12、20 μl，记录色谱图。 以峰面积（A）对进样浓度 C（μg/ml）进行线性回归，得甲硝唑线性方程为：A=14956C+5142（n=6），r=0.9999；氯霉素线性方程为：A=10343C+3288.5（n=6），r=1；水杨酸线性回归方程为：A=36578C-845.65（n=6），r=1。结果表明：甲硝唑、氯霉素、水杨酸分别在21.78～217.78 μg/ml、20.48～204.76 μg/ml、5.01～50.15 μg/ml范围内，与峰面积呈现良好的线性关系。

2.3.3 精密度实验 取“2.1.1”项下对照品溶液，按照上述色谱条件依次连续进样5次，记录色谱图，计算各组分峰面积的RSD，结果分别为0.4%（n=5）、0.6%（n=5）、0.7%（n=5），表明该方法精密度实验良好。

2.3.4 重现性实验 取批号为170207供试品2ml，精密量取，分别置6个 200 ml量瓶中，按“2.1.2”处理制成供试品溶液，按照上述色谱条件依次进样，记录色谱图，计算3组分峰面积RSD分别为0.5%（n=6）、0.7%（n=6）、0.8%（n=6）， 表明方法重现性实验良好。

2.3.5 重复性实验 取批号为170207供试品2ml，照“2.1.2”处理得供试品溶液，室温下存放，依次在同一天内第 0、2、4、8、12、16、20、24 h 进样分析，分别记录3组分峰面积，计算3组分含量RSD分别为 0.6%（n=8）、0.7%（n=8）、0.9%（n=8），结果表明供试品溶液中3组分在24 h内稳定。

2.3.6 加样回收率实验 精密吸取批号为170207供试品1 ml（含甲硝唑、氯霉素、水杨酸分别为：10.02 mg/ml、10.04 mg/ml、2.52 mg/ml）各 9 份，分别置9个200ml量瓶中，再精密称取甲硝唑、氯霉素、水杨酸对照品适量，分别按已测出供试品含量的80%、100%、120%各 3份投于上述量瓶中，按“2.1.2”方法制备成供试品溶液，按上述色谱条件分别进样10μl，记录3组分峰面积和各对照品加入量，计算各组分平均回收率及相对标准平均偏差，结果见表1。

2.4 样品含量测定 取甲硝唑、氯霉素、水杨酸对照品适量，精密称定；取3个批号的新面醑为样品，按照“2.1.1”和“2.1.2”项下制成对照品溶液和供试品溶液，对照品溶液平行制备2份，供试品每批次平行制备3份，按照上述色谱条件依次进样，记录3组分峰面积，按外标法计算3组分含量，求平均含量和相对标准平均偏差（RSD）。 结果见表2。

表1 新面醑中甲硝唑、氯霉素、水杨酸回收率结果(n=9)

表2 新面醑中甲硝唑、氯霉素、水杨酸含量测定结果及RSD(mg/mI）

3 讨论

检测波长的确定：本研究采用SPD-M20A二极管阵列检测器，通过对3组分进行全波长扫描检测，水杨酸在230 nm处的吸光度最高，甲硝唑和氯霉素在此波长也存在吸收，且根据处方得知，水杨酸处方量较少，故采用230 nm作为3组分的共同检测波长。

图1 高效液相色谱图

原标准在对该品种进行质量控制时，只是采用容量分析方法对水杨酸进行含量测定，显然已不能满足最新药典的要求，为了患者用药安全，本研究建立HPLC法对该品种3组分进行全面质量控制，探索通过一种色谱条件同时测定该品种中3组分含量的方法。通过对方法的精密度、重复性、回收率等参数进行研究，结果表明，HPLC法测定本品时的精密度、重复性、回收率均良好，故该分析方法可以作为同时测定新面醑中3个主要成分含量的测定方法，为建立质量标准提供参考依据。

[1] 张玉英，刘俊东.紫外分光光度法测定氯霉素水杨酸酊中氯霉素和水杨酸浓度[J].山东医药，2008，48（16）：46.

[2] 宋建建.高效液相色谱法测定复方甲硝唑擦剂中成分含量分析[J].中国中医药咨讯,2011,3（6）：310.

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[5] 王菊花，李容．系数倍率法测定复方氯霉素酊中两组分的含量[J]．心理医生,2011,6：222．

[6] 郭胜才，谷 娜，李 华.高效液相色谱法测定复方氯霉素醇溶液中水杨酸与氯霉素含量[J].医药导报,2010,29(6)：783-785.