结核感染T细胞斑点试验在泌尿系结核中的诊断价值

陈 禹* 李桂琴 刘旭晖 付 亮 陈国玺

（1 沈阳市第十人民医院 沈阳市胸科医院，辽宁 沈阳110044；2 上海市公共卫生临床中心，上海 201508；3 武汉市肺科医院，湖北 武汉 430000；4 深圳市第三人民医院，广东 深圳 518040）

泌尿系结核 (urinary tuberculosis，UTB) 占肺外结核的30%～40%[1]，是肺外结核中较为严重的临床类型。UTB起病隐匿，表现具有多态性，可呈午后低热、腰部疼痛、乏力、尿频、尿急、尿痛等，因通常在疾病的晚期出现症状，常导致诊断的延误，进而引起泌尿系统器官的逐渐损毁，也有报道以肾功能衰竭作为首发临床表现的UTB患者[2]。UTB的病理损坏过程，突出了进行早期、快速诊断的重要性。目前，细菌学检查为结核病诊断的“金标准”，但因UTB患者的尿液标本细菌含量少，传统涂片镜检抗酸染色阳性率低，且不能鉴别非结核分枝杆菌感染，假阳性率较高，结果往往不可靠；UTB患者的尿液标本分枝杆菌培养阳性率低、所需时间长，不能满足临床早期、快速诊治的需要；分子生物学技术简便、快速，但其敏感度也相对较低，对泌尿系结核的诊断存在局限性，不能满足临床需求；通过膀胱镜活检取病理检查或肾脏切除手术后病理检查需要一定的临床适应证，且为有创性检查，不能作为常规应用，因此迫切需要一种免疫学检测技术以提高泌尿系结核的诊断敏感度。目前，临床上应用由ELISPOT技术发展而来的结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）进行结核分枝杆菌感染的早期诊断，此方法使用结核分枝杆菌特异性抗原刺激外周血单个核细胞（PBMC），通过细胞因子γ干扰素（INF-γ）的分泌检测抗原特异性T淋巴细胞的应答反应，从而判断结核分枝杆菌感染的状态，具有较高的敏感度和特异度[3-4]。本实验通过对患者外周血进行T-SPOT.TB 检测，并与尿液涂片抗酸杆菌检测、MGIT960分枝杆菌培养、Xpert检测3种检测方法比较，探讨其在泌尿系结核诊断及鉴别诊断中的临床应用价值，从而提高泌尿系结核早期诊断水平。

1 资料与方法

1.1 研究对象：2016年2月至2017年2月在沈阳市胸科医院、上海市公共卫生临床中心、武汉市肺科医院、深圳市第三人民医院等4家医院连续纳入临床疑似UTB患者122例。在所有纳入患者中，3例被剔除，其中2例为HIV感染，1例为非结核分枝杆菌感染，最终进行数据分析的样本数量为119例患者。119例患者入组条件为具有尿频、尿急、尿痛、血尿、腰痛等临床症状或尿常规检查异常患者。所有患者临床资料完整，取样前均签署知情同意书，HIV检测阴性，未接受抗结核药物治疗或抗结核药物治疗＜1个月、未进行泌尿系手术治疗。

结核病组：临床诊断的UTB患者的诊断依据为：BACTEC MGIT960分枝杆菌培养阳性；典型的临床表现，实验室尿常规、结核菌素试验等相关检查；泌尿系影像学检查；膀胱镜活检，以及对抗结核药物治疗反应良好等。

对照组：患者没有细菌学等其他结核方面证据、并且抗结核药物治疗无效者则诊断为非泌尿系结核病。对照组患者要求既往均无结核病病史和结核病接触史、无合并活动性肺结核或影像学未显示陈旧性结核病变，肿瘤患者未经过放疗、化疗和手术治疗，未接受免疫抑制剂和增强剂治疗。

本研究过程经我院伦理委员会审核，所有研究对象对临床诊断过程知情同意。患者的人口学信息及临床特征（如年龄、性别、病史、泌尿系统器官累及的范围及病变形式）等内容均来源于临床原始病史记录。

1.2 实验室检测方法

1.2.1 T-SPOT.TB检测：采用T-SPOT.TB试剂盒（牛津Immunotec公司产品，英国）检测分泌IFN-γ的T细胞，严格按照说明书操作。抽取患者外周血4～5 mL，将抗凝液和血液混匀待用；放置室温于4 h内进行PBMCs的分离，用淋巴细胞分离液分离PBMCs，配制细胞浓度为2.5×106个/mL的细胞悬液至少300 μL待用。每份待测样本需要4个检测孔：空白对照孔、检测孔A（抗原A）和检测孔B（抗原B）、阳性质控对照[植物血凝素（phytohaemag-glutinin，PHA）对照]，在各反应孔内加入下列试剂：加入50 μL细胞培养液至每个空白对照孔内；加入50 μL抗原A溶液至每个必要的检测孔内；加入50 μL抗原B溶液至每个必要的检测孔内；加入50 μL阳性质控至每个细胞功能控制孔内；然后每孔加入100 μL配制好的浓度为2.5×106个/mL的PBMCs悬液，将反应板放入湿润的培养箱在37 ℃、5%CO2培养18～20 h，弃培养上清液，每个反应孔用200 μL PBS缓冲液清洗4次，在每个孔中加入50 μL标记抗体工作液，2～8 ℃孵育1 h，弃去液体，每孔用200 μL PBS缓冲液清洗4次，每孔加入50μL底物显色溶液室温孵育7 min，用蒸溜水或去离子水冲洗终止反应，将板放入37 ℃烘箱干燥或者室温干燥，记数着色的斑点，每一个点代表一个分泌IFN-γ的T淋巴细胞。根据检测孔的反应判断结果，检测结果为“阳性”，参照以下标准：①空白对照孔斑点数为0～5个时且（抗原A或抗原B孔斑点数）-（空白对照孔斑点数）≥6；②空白对照孔斑点数为6～10个时且（抗原A或抗原B孔斑点数）≥2×（空白对照孔斑点数）。如果上述标准不符合，且阳性对照孔正常时，检测结果为“阴性”。

表1 T-SPOT.TB、抗酸杆菌涂片、Xpert、MGIT960液体培养的检测结果分析

1.2.2 尿液标本涂片查抗酸杆菌：一次性吸管吸取少许无菌标本采集管中的尿标本涂于载玻片上进行荧光染色（珠海贝索生物有限公司），置光学显微镜下（日本Olympus公司）观察计数，以每50个视野抗酸杆菌≥3条为阳性。

1.2.3 MGIT960分枝杆菌液体培养（美国BD公司）：取2 mL尿液标本用于培养，严格按照MGIT960系统操作说明书进行前处理，液体培养时间设定为42 d。仪器自动报告阳性后，取培养液涂片镜检，若查到抗酸杆菌则为阳性；若未见抗酸杆菌则为阴性。

1.2.4 Xpert检测：取1 mL尿液标本与标配处理液常规按1∶2比例混合，旋紧管盖，在涡旋振荡器上涡旋振荡15～30 s，室温静置15 min，使标本充分液化。吸取2 mL液化的标本至Xpert反应试剂盒，置于Xpert检测系统（美国Cepheid 公司）模块，仪器开始进行自动化检测。约2 h反应结束后，在检测系统窗口下可直接观察测试结果。

2 结 果

2.1 确诊患者情况：119例患者中，59例（49.6%）患者临床确诊为泌尿系统结核，其中25例（21.0%）MGIT960分枝杆菌培养阳性；34例（28.5%）以膀胱镜活检病理、泌尿系影像学表现、典型临床表现及对抗结核药物治疗有效等为诊断依据。60例（50.4%）患者临床诊断为非结核病患者。

2.2 T-SPOT.TB诊断泌尿系结核的敏感度和特异度：以临床诊断作为金标准，外周血T-SPOT.TB检测，尿液涂片抗酸杆菌检测、MGIT960分枝杆菌培养、Xpert检测的敏感度分别为86.4%（51/59）、11.9%（7/59）、42.4%（25/59）和64.4%（38/59）；特异度分别为75.0%（45/60）、95.0（57/60）、100.0%（60/60）、100.0%（60/60）。涂片、培养、Xpert检测均阴性而临床诊断为泌尿系结核的患者血T-SPOT.TB检测的阳性率为81.3%（26/32）。见表1。

2.3 UTB患者的一般情况和临床特征：进一步分析UTB患者的一般情况及临床特征。本研究显示，UTB在各年龄段均有发病，但以中老年男性患者居多。UTB患者的病程较长，病程1.5个～3年。UTB患者主要表现为尿频、尿急、夜尿增多及腰痛等症状；可出现酸性尿及无菌脓尿，易伴有严重的肾脏破环；并发肾盂积液，输尿管增厚、狭窄或扩张及膀胱挛缩相关的尿路梗阻。

3 讨 论

UTB起病隐匿，是肺外结核中较为严重的一种临床类型，通常在疾病的晚期出现症状，因此常导致诊断的延误及泌尿系统器官的逐渐损毁。考虑到传统细菌学检验方法耗时长，阳性率低，操作复杂等诸多缺点，临床上迫切需要一种能早期、快速发现泌尿系结核且敏感度及特异度均较高的诊断技术。

T-SPOT.TB检测技术的优越性以及对泌尿系结核诊断的应用价值：以T细胞免疫应答为基础的T-SPOT.TB检测技术作为一种新的结核分枝杆菌感染的快速诊断工具被广泛应用于临床，具有较高的敏感度和特异度，即使在免疫力低下的人群中，T-SPOT.TB依然能够维持较高的敏感度[5]。由于两种特异性结核分枝杆菌刺激原ESAT-6和CFP-10的使用，使得此方法的敏感度和特异度大幅度增加，目前已成为欧美国家检测结核分枝杆菌感染的临床常规方法之一。本研究中T-SPOT.TB检测泌尿系结核的敏感度为86.4%（51/59），特异度为75.0%（45/60），且在涂片、培养、Xpert检测均阴性而临床诊断为泌尿系结核的患者中血T-SPOT.TB检测的阳性率为81.3%（26/32），充分弥补了泌尿系结核病原学检测敏感度低的不足。此结果提示以结核分枝杆菌RDI区编码蛋白ESAT-6和CFP-10为抗原的T-SPOT.TB检测在泌尿系结核中有一定的诊断价值。

综上所述，由于临床表现的多样化和不典型性，UTB患者的诊断十分困难。对于可疑患者应尽早进行T-SPOT.TB检测，更早更多的获得结核病诊断依据及有效的进行鉴别诊断，在结核病的高发地区尤为重要。是早期诊断UTB患者、避免肾功能减损及手术治疗的关键。此外，T-SPOT.TB检测也有极少的假阳性和假阴性比例，出现假阳性的原因可能是患者曾经有过结核分枝杆菌潜伏性感染，出现假阴性的原因可能是标本在细胞免疫发生前获取，或者少数免疫系统功能不健全，因此当其值接近临界值时.应慎重参考，结合临床表现及其他辅助检查进一步明确诊断。

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[5] 张丽帆,刘晓清.7干扰素释放分析T-SPOT.TB诊断结核感染临床应用进展[J].中国医学科学院学报,2009,31(4)：506-510.