脑膜瘤组织中白血病相关蛋白16基因的表达变化及意义

任贺成,马晓东

(1天津市环湖医院,天津300350；2解放军总医院)

白血病相关蛋白16(LRP-16)基因是近年发现的一种新的雌激素反应基因，最早发现于白血病的相关研究中。基因表达序列分析(SAGE)谱分析发现LRP-16在增殖活跃的雌激素相关正常组织(如睾丸、卵巢等)中高表达[1]。后续研究发现在雌激素相关肿瘤组织中，如乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌等，LRP-16多呈高表达，并与肿瘤的恶性生物学行为及不良预后有关[1～13]。脑膜瘤是最常见的颅内肿瘤之一，起源于蛛网膜颗粒的脑膜上皮细胞。脑膜瘤大多数为良性(WHOⅠ级)；不典型脑膜瘤(WHO Ⅱ级)占所有脑膜瘤的3%～7%；恶性脑膜瘤(WHO Ⅲ级)更少，占所有脑膜瘤的1%～3%。既往研究发现，性激素与脑膜瘤密切相关。研究发现性激素可促进体外培养的脑膜瘤细胞生长增殖，其中雌激素作用最明显；脑膜瘤患者血浆性激素水平也多异于正常。与孕激素(75%)、雄激素(63%)相比，虽然雌激素受体(ER)在脑膜瘤组织中的表达率不高(22%)，但ER的表达与恶性脑膜瘤的不良预后相关[13]。与雌激素相关的LRP-16在脑膜瘤组织中的表达情况尚不明确。本研究旨在初步探讨LRP-16在脑膜瘤组织中的表达情况及其意义，为脑膜瘤发病机制及治疗研究提供一个新思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2006年10月～2007年5月解放军总医院神经外科经手术治疗并经病理证实的脑膜瘤患者42例(实验组)，其中男9例、女33例，年龄21～70(49.26±10.8)岁。病理分级：WHO Ⅰ级34例，WHO Ⅱ级3例，WHO Ⅲ级5例。按病理分级分为良性组34例，非良性组8例。以高颅压症状起病者25例，以局部功能障碍起病者17例；病程(7.5±2.3)个月。纳入标准：病理诊断为脑膜瘤患者;首次手术患者;年龄18～70岁。排除标准：复发后再次手术及术前行放、化疗者;术中电凝灼烧的患者;合并肿瘤性综合征的患者(如神经纤维瘤病)。脑外伤急症手术患者32例(对照组)，男8例、女24例，年龄19～60(48.35±11.2)岁。纳入标准:闭合性颅脑损伤并行硬膜扩大修补手术患者；年龄18～70岁。排除标准：开放性颅脑损伤，合并脑膜疾病(如脑膜炎)或颅内肿瘤者。两组患者的年龄和性别有可比性。均取得患者及家属同意，并签署知情同意书。术中取实验组脑膜瘤组织及对照组正常脑膜组织，标本取下后，分两份，一份液氮保存供核酸与蛋白质抽提，另一份甲醛固定，切片蜡封供免疫组化检测。

1.2 组织雄激素受体(AR)、ER、孕激素受体(PR)及增殖细胞核抗原(PCNA)的检测 采用免疫组化SP法。石蜡切片脱蜡、水化、冲洗，修复；切片加过氧化酶阻断溶液(50 μL)，室温下孵育(10 min)，冲洗；加正常非免疫动物血清(50 μL)，孵育(室温10 min)；除去血清，加一抗(1∶50倍稀释，50 μL)，4 ℃过夜； PBS冲洗，加生物素标记的二抗，室温下孵育10 min，冲洗；加链霉素抗生物素-过氧化酶溶液，孵育，冲洗；加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察；苏木素复染，冲洗返蓝；经过梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察结果。以细胞内有棕黄色颗粒者为阳性细胞。显微镜(×400)下随机选4个视野，计算阳性细胞个数，取平均值。AR、ER、PR染色中阳性细胞数>10%记为阳性标本，统计阳性标本的个数用以统计学分析； 计算PCNA阳性细胞占肿瘤细胞的比例(PCNA-LI)，用以表示脑膜瘤细胞的增殖活性。

1.3 组织LRP-16蛋白的检测 采用Western blotting法。主要步骤包括①组织总蛋白的提取：裂解液在4 ℃下12 000 r/min离心20 min，取上清再在4 ℃下12 000 r/min离心20 min。②样品蛋白含量的测定：标准品以0 μg调零在分光光度计上OD595比色，以测得的OD值为横坐标，对应的蛋白浓度为纵坐标制成标准曲线；样品在分光光度计上OD595比色，以测得的OD值计算蛋白浓度。③SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：灌胶时，沿玻璃加入，分离胶的高度到玻璃板的2/3即可。上样时样品浓度与对照浓度相等，用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。电泳时电泳仪电压调至100 V，当染料溴酚兰进入分离胶后，将电压调高到130 V，继续电泳使溴酚兰至玻璃板下沿。④转膜。⑤封闭、抗体孵育及曝光：按说明书加入一抗、二抗。扫描结果保存为图片文件，用Image J软件测量LRP-16和内参 (β-actin)显影条带的灰度值，以二者灰度值比(LRP-16/β-actin)作为样本中LRP-16的相对表达水平。

1.4 组织LRP-16 mRNA的检测 采用RT-PCR法。主要步骤包括：①RNA抽提和纯化：RNA的浓度=OD260×稀释倍数×0.04 μg/μL，OD260/280 在1.8～2.1视为抽提的RNA的纯度很高。②逆转录反应：反应体系100 mL(上述RNA溶液38.5 mL，10×RT buffer 10 mL，MgCl2(25 mmol/L) 22 mL，dNTP mixture(2.5 mmol/L) 20 mL，random hexamers(50 mmol/L) 5 mL，Rnase抑制剂(20 U/mL) 2 mL，逆转录酶(50 U/mL) 2.5 mL。反应程序：25 ℃ 10 min，42 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min，4 ℃保存。③引物设计和合成：以GAPDH的值校正特异扩增基因的量，各基因扩增所用的引物序列如下：LRP-16-165 F：5′-GCGGACCTCGGCGGGAGTTGG-3′；LRP-16-903 R：5′-CAGCCGGTCCACCTTGTCCTTGT-3′；GAPDH F:5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′；GAPDH R：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。④荧光实时定量PCR反应体系和反应条件：SYBR®Green PCR Master Mix 12.5 μL，1 mmol/L正向、反向引物各2.5 μL，模板(RT产物1∶5稀释)2.0 μL，H2O 5.25 μL，总体积为25.0 μL；以NTC、NRTC为阴性对照。反应条件：95 ℃ 8.5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，60～95 ℃ 20 min。⑤将不同浓度定量模板的对数和相应CT值作图，做标准曲线。用已知不同浓度的RNA反转录成cDNA制作标准曲线。浓度分别为10、20、30、40 ng/μL。以目的基因与GAPDH的比值(LRP-16/GAPDH)表示LRP-16 mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 两组LRP-16、AR、ER、PR、PCNA表达比较 实验组LRP-16灰度值为0.729±0.249，高于对照组(0.015±0.005)(P<0.01)。实验组LRP-16 mRNA的相对表达量为0.205±0.134，高于对照组(0.003±0.001)(P<0.01)。实验组PR阳性率为69.0%(29/42)，PCNA-LI为88.1%(37/42)，对照组未检测到PR和PCNA阳性标本。所有标本未检测到AR、ER染色。

2.2 脑膜瘤组织LRP-16 mRNA表达与患者PR、PCNA及WHO病理分级的关系 良性组LRP-16 mRNA的相对表达量为0.169±0.081，非良性组为0.361±0.200，两者比较，P<0.05。PR阳性患者及PR阴性患者LRP-16 mRNA相对表达量分别为0.216 ± 0.142、0.180 ± 0.115，差异无统计学意义(P>0.05)。实验组LRP-16 mRNA与PCNA-LI呈正相关(rs=0.769，P<0.01)。因所有标本未检测到AR、ER染色，LRP-16表达与AR、ER的相关关系未行探讨。

3 讨论

LRP-16基因是一种新的人类基因，1999年发现于白血病的相关研究中，故得名“白血病相关蛋白”。该基因定位于染色体11q12.1，含外显子11个，转录本长1 225 bp，编码325个氨基酸，翻译产物是一种核蛋白，属于macro domain家族。SAGE谱分析发现在各种人类细胞内LRP-16均有表达，增殖活跃的组织(睾丸、卵巢等)或肿瘤细胞中，该基因呈高表达[1]。LRP-16是一种雌激素反应基因，雌激素、雄激素可以上调其表达水平。

研究发现，LRP-16过表达可以促进乳腺癌MCF-7细胞增殖，抑制LRP-16表达可限制MCF-7细胞的增殖；同时LRP-16与MCF-7细胞的体外黏附、侵袭与迁移能力有关[11]。对人乳腺癌研究也发现，LRP-16 mRNA的表达量与乳腺癌直径呈正相关，同时LRP-16 mRNA与乳腺癌的临床分期、淋巴结转移等有关[4,9]。对于子宫内膜癌Ishikawa细胞，LRP-16过表达能提高其体外侵袭能力，可能通过下调E-钙黏着素起作用[12]。对于浆液性卵巢肿瘤的研究提示，LRP-16在卵巢癌中的表达高于交界性肿瘤，并与其临床分期呈正相关[2,5]。对于前列腺癌，LRP-16过表达能够促进前列腺癌DU145细胞的生长。LRP-16基因的表达与非小细胞肺癌的分化程度有关[10]。临床病理研究发现，LRP-16与肺部神经内分泌肿瘤的分型、临床分期和患者生存期有关[3]。对于消化系统恶性肿瘤，LRP-16在胃癌、结肠癌中均呈高表达，并与肿瘤的临床病理分期、大小、浸润深度、淋巴结转移和远处转移相关，过表达LRP-16提示不良预后[6,7]。

脑膜瘤是最常见颅内肿瘤之一，起源于蛛网膜颗粒的脑膜上皮细胞。虽然大多数为良性，但恶性者并不罕见。脑膜瘤与性激素密切相关。女性脑膜瘤患者多于男性，绝经期前后女性性激素变化，此时期是女性脑膜瘤的高发年龄。脑膜瘤常于妊娠期而生长加速，可能与妊娠期性激素增加有关。脑膜瘤可并发于其他性激素相关肿瘤，如乳腺癌。本研究结果显示，实验组LRP-16基因在mRNA及蛋白水平的表达均高于对照组；并且LRP-16 mRNA在非良性脑膜瘤中的表达高于良性肿瘤。提示LRP-16基因可能与脑膜瘤的发生发展有关，且可能与恶性的脑膜瘤关系更为密切。PCNA-LI是评价细胞增殖活性的良好指标。本研究显示LRP-16 mRNA在脑膜瘤中的表达与PCNA-LI呈正相关，提示LRP-16表达与脑膜瘤的细胞增殖呈正相关关系。这些结果与既往研究发现的LRP-16与性激素肿瘤相关、并与肿瘤的恶性生物学行为相关的特点相符合。虽然本研究显示PR阳性组脑膜瘤组织中的LRP-16 mRNA表达高于PR阴性组，但这一发现并无统计学意义。遗憾的是本文脑膜瘤标本中AR、ER均为阴性。阴性结果可能与下列因素有关：既往研究提示AR、ER在脑膜瘤组织中阳性率不高，ER与恶性脑膜瘤有关，而本组脑膜瘤例数较少，恶性脑膜瘤更少；实验试剂、实验方法和技术经验方面的因素造成假阴性结果。

总之，本研究结果提示，脑膜瘤组织中LRP-16基因的表达升高，LRP-16的表达与脑膜瘤的细胞增殖和病理分级有关。然而本研究仍有许多不足之处，如研究对象例数较少，实验设计简单等。LRP-16与脑膜瘤的关系有待于进一步深入研究。

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