麒麟菜多肽对血小板聚集及角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓形成的影响

2018-03-22余华军伍俊吴尚李慧敏黄慧张海涛

解放军医学杂志 2018年2期

余华军，伍俊，吴尚，李慧敏，黄慧，张海涛

血栓性疾病是严重危害人类健康的疾病之一，在急性冠脉综合征、缺血性脑卒中等心血管疾病的发病机制中起着重要作用。随着环境的巨变及社会压力的剧增，血栓的发病率与病死率逐年上升，而且血栓性疾病的致残率也居高不下。因此寻找新型的、能够防治血栓形成的天然药物有深远的社会意义和经济价值。

在前期研究中，本课题组从麒麟菜中分离出具有抑制血小板聚集功能的多肽组分，显示麒麟菜多肽在抑制血栓形成领域可能有潜在应用价值。目前常用角叉菜胶诱导制备小鼠尾部血栓形成模型[1-2]，该法可根据鼠尾皮肤颜色变化观察血栓形成的过程，并分析药物对血栓形成的影响，方法简单而直观。本研究采用腹腔注射角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓模型[3]，观察麒麟菜多肽对血栓形成的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1自动低压液相色谱分离层析仪(上海嘉鹏生物公司)，CF16RX冷冻离心机(日本 Hitachi公司)，FLASH连续光谱荧光酶标仪(德国 Thermo公司)，HP1100高效液相色谱仪(美国HP公司)，电泳设备(美国Bio-Rad公司)。

1.1.2 动物和试剂 SPF级昆明小鼠35只，18～22g，雌雄各半，购自广东医科大学实验动物中心。麒麟菜(海南琼海)，Sephadex G-50 (台州市路桥四甲生化塑料厂)，氯吡格雷、二磷酸腺苷(ADP)、凝血酶(北京鼎国公司)，角叉菜胶(美国Sigma公司)，其余为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 麒麟菜多肽的制备从海南琼海收集麒麟菜，用蒸馏水漂洗干净，置于20mmol/L的盐酸溶液中浸泡过夜。第，天用匀浆机打碎匀浆，匀浆液8000r/min离心30min，收集上清液；上清加入1.5%KCl再次离心，收集上清液。将上清液用Sephadex G-50分离，20mmol/L盐酸洗脱，1.0ml/min流速，收集280nm处具有光吸收峰的物质。共收集2个洗脱峰，多肽成分集中在第2个收集峰。用高效液相色谱(HPLC)进一步纯化该多肽。高效液相测试参数如下：色谱柱C18(250.0mm×4.6mm)，检测波长280nm，柱温25℃，上样量20μl，流速1ml/min；流动相B为0.1%三氟乙酸，流动相C为乙腈(CAN)；梯度洗脱0～3min为B/C=97.0/3.0，3～5min为B/C=97.0/3.0，5～10min为B/C=60.0/40.0，10～20min为B/C=60.0/40.0[4]。纯化的多肽经SDS-PAGE电泳分离蛋白后用考马斯亮蓝染色。

1.2.2 光学比浊法检测血小板聚集富血小板血浆(platelet rich plasma，PRP)和乏血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)的制备方法为取2管枸橼酸盐抗凝新鲜猪血，静置30min，分别经800r/min、10min和4000r/min、10min离心取上清，分别得到PRP和PPP[5]。

实验分为4组：正常生理盐水(N)组、麒麟菜多肽低剂量(Q-L)组、麒麟菜多肽中剂量(Q-M)组、麒麟菜多肽高剂量(Q-H)组。根据课题组前期实验，设置麒麟菜多肽低、中、高剂量分别为2.5、5.0、10.0μg/ml。铺96孔板，先加入100μl血小板/孔，每组设置5个复孔，再分别按分组情况加入生理盐水和麒麟菜多肽10μl孵育30min，最后分别以ADP[6-7]、凝血酶[8-9]诱导，混匀30s，使用FLASH连续光谱荧光酶标仪(405nm波长，50s/次，15min)动态检测血小板聚集情况。以PPP作为空白对照，分别加入10μl ADP、1U凝血酶诱聚剂至PRP，在PRP中透光度改变最大时即得到血小板最大聚集率(maximun aggregation rate，MAR)，以百分数表示，4h内完成检测。

1.2.3 麒麟菜多肽对角叉菜胶引起的小鼠尾部血栓形成的影响将35只小鼠随机分为5组：正常生理盐水(N)组、麒麟菜多肽低剂量(Q-L1)组、麒麟菜多肽中剂量(Q-M1)组、麒麟菜多肽高剂量(Q-H1)组、氯吡格雷(L)组。根据文献[10]并结合课题组前期实验，设置麒麟菜多肽低、中、高剂量分别为15、30、60mg/kg，氯吡格雷100mg/kg。每组动物各7只，各组均按0.2ml/10g灌胃给予相应药液，每天1次，连续7d。于末次给药后1h，各组于小鼠腹腔注射0.2%角叉菜胶0.2ml/10g以诱发血栓形成。环境温度控制在18℃，造模24h后用游标卡尺测量小鼠尾部长度及尾部血栓形成长度，血栓形成长度占尾部总长度百分比即为血栓形成相对比例(%)。

1.3 统计学处理采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结　果

2.1 麒麟菜多肽的制备及纯化麒麟菜样品的SephdexG-50凝胶层析法洗脱图谱如图1所示，多肽成分集中在B峰。用高效液相色谱的方法进一步纯化收集B峰，获得麒麟菜多肽，测试结果见图2。SDS-PAGE电泳显示只有一条区带(图3)，证明理论纯度大于90%。

图1 麒麟菜多肽的SephdexG-50洗脱曲线Fig. 1 The elution curve of samples from Eucheuma in SephdexG-50

图2 麒麟菜多肽高效液相分离图谱Fig. 2 Separate map of Eucheuma peptides by HPLC

图3 麒麟菜多肽SDS-PAGE电泳图谱Fig. 3 SDS- polyacrylamide gel electrophoresis of peptides from Eucheuma

2.2 比浊法对聚集的检测由表1可见，在第4个测试点时)，血小板达MAR，2.5、5.0和10.0μg/ml浓度的麒麟菜多肽对ADP诱导的血小板聚集的抑制率分别为38.16%、28.96%和39.05%，与生理盐水组相比差异有统计学意义(P＜0.01)。

表1 麒麟菜多肽抗ADP诱导血小板聚集的作用(±s，n=6)Tab. 1 Effects of peptide on platelet aggregation induced by ADP in Eucheuma (±s, n=6)

Group N. Saline treated group; Q-L, Q-M, Q-H group. Platelets in vitro treated with Eucheuma peptide at a dose of 2.5, 5.0, 10.0μg/ml,respectively; MAR. Max aggregation ratio; (1)P＜0.01 compared with Group N

Group　Dose (μg/ml)　MAR(%)　Inhibition (%)N 0 100　0 Q-L　2.5　61.84±3.25(1)　38.16±3.25(1)Q-M　5.0　71.04±2.42(1)　28.96±2.42(1)Q-H　10.0　60.95±2.78(1)　39.05±2.78(1)

由表2可见，在第9个测试点时(8min)，血小板达到MAR，2.5、5.0和10.0μg/ml麒麟菜多肽对凝血酶诱导的血小板聚集的抑制率分别为24.66%、30.04%和26.26%，与生理盐水组相比差异有统计学意义(P＜0.01)。

表2 麒麟菜多肽抗凝血酶诱导血小板聚集的作用(x±s，n=6)Tab. 2 Effect of peptide on platelet aggregation induced by thrombin in Eucheuma (±s, n=6)

Group　Dose (μg/ml)　MAR (%)　Inhibition rate (%)N 0 100　0 Q-L　2.5　75.34 ±1.23(1)　24.66 ±1.23(1)Q-M　5.0　69.96 ±1.46(1)　30.04 ±1.46(1)Q-H　10　73.74 ±1.78(1)　26.26±1.78(1)

2.3 麒麟菜多肽对角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓形成的影响由表3可见，15、30和60mg/kg麒麟菜多肽对角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓形成有抑制作用，与生理盐水组相比差异有统计学意义(P＜0.01)。

表3 麒麟菜多肽对角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓形成的作用(±s，n=7)Tab. 3 Effects of peptide on mouse tail thrombosis induced by carrageenan in Eucheuma (±s, n=7)

Group N. Saline treated group; Q-L1, Q-M1, Q-H1 group. Mice treated with Eucheuma peptide at a dose of 15, 30, 60 respectively;L group. Mice treated with clopidogrel at a dose of 100mg/kg; (1)P＜0.01 compared with Group N

Group　Dose (mg/kg)　Black tail length/Total length of a tail (%)N 0 63.88±12.04 Q-L1　15　36.89±9.64(1)Q-M1　30　17.25±5.01(1)Q-H1　60　22.99±7.76(1)L 100　18.96±9.17(1)

3 讨　论

血栓类疾病复发率与致残率非常高，血栓形成难以监测，目前采用的治疗方法有早期预防、诊断和及时治疗。血小板活化诱导的血栓形成在血栓性疾病的发生和发展中发挥重要作用。因此，减少血小板聚集是预防血栓形成的重要手段。临床上广泛应用影响血小板活化的药物来抑制血栓形成。目前，常用的抗血小板聚集药物有环氧化酶-1(COX-1)抑制剂、二磷酸腺苷(ADP)受体拮抗剂、血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂、血小板激活因子受体拮抗剂、凝血酶和凝血因子(Xa)抑制剂、钙离子(Ca2+)通道抑制剂等。

血小板聚集是血栓形成的主要过程，是通过血小板表面的受体激活引发的。这些受体包括凝血酶受体、ADP受体、凝血因子受体等。ADP是体内的血小板激活物质，通过与血小板膜上ADP受体结合引起血小板聚集。ADP受体拮抗剂的代表药物有氯吡格雷、普拉格雷、替格瑞洛等[11]。凝血酶受体属于G蛋白偶联受体，在凝血酶介导的血小板激活过程中发挥重要作用[12]。凝血过程中关键因子为一种糖基化蛋白酶Ⅹa因子，其可激活凝血酶原转变为凝血酶，其抑制剂有利伐沙班[13]和阿哌沙班[14]等。

血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa是一种膜结合蛋白，作为纤维蛋白原受体，由α和β两个亚单位组成的异二聚体，每个亚单位都含有胞内区、跨膜区及胞外区。在激活剂作用下，血小板活化并导致血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体的空间构象发生变化，以便与纤维蛋白原或血管病友性因子(vWF)等结合，从而诱导血小板发生聚集[15]。ADP、凝血酶、血栓素A2(TXA2)可以活化血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体[16]，血小板通过活化的受体与相邻血小板配体连接，诱发聚集，从而形成血栓。目前研究认为血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体是诱导血小板发生聚集的最后共同通路，因此血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂也是防止血栓形成的一个重要靶点[17]。

氯吡格雷是一种常用的抗血小板药物，可与血小板膜表面ADP受体结合，使纤维蛋白原无法与血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体结合，从而抑制血小板相互聚集，但该药物引起的不良反应已陆续报道[18]。筛选和研发选择性高、作用强、可逆转、不良反应小、口服的新型抗血小板聚集药物是当今研究的热点。

麒麟菜(Eucheuma)是一种可食用的海藻，又称鸡脚菜、鹿角菜，盛产于我国海南、广东、广西和东南亚等沿海地区[19]。麒麟菜富含膳食纤维、多糖和矿物质，但必需氨基酸和脂肪含量较低，具有活血化瘀的功效[20-21]。光学比浊法是检测血小板功能的“金标准”[22-23]，本研究也采用此法证实课题组提取的多肽具有抗血小板聚集活性。角叉菜胶是从海藻中提取的硫酸多糖，可用于制备多种组织炎症模型，是一种简便易行的血栓造模试剂，其机制为由于炎症损伤血管内皮细胞，在IL-1β的作用下，炎细胞趋化、浸润，激活外源性凝血系统，导致血栓形成，并在血栓形成后抑制纤溶系统[24]。

本研究结果显示，课题组提取的麒麟菜多肽具有抗ADP和凝血酶诱导血小板聚集的活性，三种浓度(2.5、5.0、10.0μg/ml)的麒麟菜多肽均能降低ADP和凝血酶诱导血小板聚集率。此外，我们还通过动物实验还发现麒麟菜多肽能显著抑制角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓的形成。实验结果显示，麒麟菜多肽可能是通过影响ADP受体、凝血酶受体和Ⅹa因子等作用，抑制血栓形成。麒麟菜多肽是否通过直接抑制ADP受体、凝血酶受体和Ⅹa因子共同途径(血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体[25])从而抑制血栓形成的分子机制，还需要进一步研究。

总之，麒麟菜来源的多肽分子具有抑制血栓形成的功能，有可能转化成为一种新型的防治血栓形成的药物，有进一步研究开发的潜力。

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