维生素D受体基因多样性与2型糖尿病伴重度慢性牙周炎的关系

王鑫

(锦州医科大学附属第二医院儿童口腔科，辽宁 锦州 121000)

随着中国人生活水平和生活习惯的不断进步，Ⅱ型糖尿病的患者随着时间不断增加，同时已经被证实为糖尿病第六大并发症的牙周炎也引起越来越多学者的关注。大量研究表明糖尿病患者中牙周炎的发病率显著提高，另外牙周支持组织的炎症刺激也是糖尿病发病的促进因素之一。本研究采用PCR和酶切的方法对142例健康对照组以及单纯糖尿病组、单纯重度慢性牙周炎组、Ⅱ型糖尿病伴重度慢性牙周炎组外周血中维生素D受体FokⅠ位点等位基因进行检测，探究维生素D受体的基因多样性与2型糖尿病伴重度慢性牙周炎之间的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究对象为锦州医科大学附属第二医院及内分泌科病人，共142人。其中：男性83人，女性59人，年龄分布：34～72岁。所有患者均为长期居住在锦州以及周边地区的汉族人群并知情本次实验目的，且常规牙周临床指标的评估。

1.1.1 健康对照组 研究对象均牙周健康，无系统性疾病。平均年龄(49.72±5.36)岁，其中：男性17例，女性13例。

1.1.2 单纯糖尿病组 依据1999年WHO糖尿病诊断标准：空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L和(或)糖耐量实验2 h血糖(OGTT2hPG)≥11.1 mmol/L，存在显著的胰岛素抵抗伴有胰岛素分泌相对不足，或胰岛素分泌不足为主伴有或不伴有胰岛素抵抗。且研究对象无其他系统性疾病及并发症。

1.1.3 重度慢性牙周炎组 诊断标准：(1)牙周袋>6.0 mm，附着丧失5.0 mm，存在牙龈炎症和探诊出血；(2)X线片示牙槽骨吸收超过牙根的1/2长度；(3)全口牙平均CAL≥2.5 mm，至少3个区有1个或多个邻面位点CAL≥2.5 mm。

1.1.4 Ⅱ型糖尿病伴重度慢性牙周炎组 诊断标准：(1)无严重糖尿病并发症，口腔残留牙不少于15颗；(2)至少有6个位点附着丧失﹥4.0 mm，探诊深度﹥4.0 mm；(3)X线显示多个位点牙槽骨吸收超过牙根的1/3长度；(4) 至少半年未接受牙周治疗；(5)近期糖尿病情及用药无改变。

1.2 样本采集

所有研究对象均在空腹下采取5 mL前臂静脉血，标本经EDTA抗凝后储存于-70 ℃。

1.3 维生素D受体FokⅠ位点等位基因的检测

1.3.1 外周血基因组DNA的提取 基因组DNA的提取采用DNA快速提取试剂盒，按说明书进行操作。取2 μL DNA样品，紫外分光光度仪测定OD260、OD280，计算OD260/OD280比值，比值介于1.7～2.0之间表示DNA纯度良好。

1.3.2 引物设计及PCR扩增 维生素D受体特异性引物：

上游:5’-AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGG CTC-3’

血浆快速反应素试验阴性神经梅毒患者的临床特点 … …………………………… 刘晖，季孙平，张尧，等 29

下游:5’-ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3’

扩增片段为267 bp

反应体系：

模板DNA2.0μLdNTP4.0μL引物0.5μLTaq酶0.2μL10xPCR反应缓冲液2.0μL灭菌蒸馏水11.3μL总体积20.0μL

维生素D受体循环条件：预变性：94 ℃、4 min；变性：94 ℃、45 s；退火：60 ℃、45 s；延伸：72 ℃、45 s；循环35次；再延伸：72 ℃、6 min。

1.3.3 PCR扩增产物电泳检测 将Loading buffer 加入扩增产物中，产物采用经溴化乙锭(1.0 mg/mL)染色的琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，时间30 min，经自动凝胶成像分析仪拍照。

1.3.4 酶切体系

PCR扩增产物5.0μL10x反应缓冲液1.0μLFokⅠ内切酶0.2μL无菌去离子水3.6μL总体积10.0μL

反应条件:37 ℃水浴12 h，65 ℃ 20 min灭活内切酶终止酶反应。

2 结 果

2.1 维生素D受体FokⅠ位点等位基因携带频率检测

维生素D受体基因的PCR扩增、FokⅠ酶切均获成功，酶切后分别出现3种基因型：Ⅰ/Ⅰ型片段为61、206 bp；Ⅰ/Ⅱ型片段为61、206、267 bp；Ⅱ/Ⅱ型片段为267 bp。通过对维生素D受体等位基因的检测，表明在重度慢性牙周炎组维生素D受体FokⅠ位点Ⅱ/Ⅱ纯合子基因型的例数为7例，携带频率为13.46%，Ⅱ型等位基因携带频率为37.50%，而Ⅱ型糖尿病合并重度慢性牙周炎组中，维生素D受体FokⅠ位点Ⅱ/Ⅱ纯合子基因型为5例，其携带频率为13.16%，Ⅱ型等位基因携带频率为36.84%。统计结果显示组间基因携带频率有统计学意义(χ2=17.081，P=0.009﹤0.01)，等位基因频率分布亦存在统计学意义(χ2=14.560，P=0.002﹤0.01)，见表1。

表1 维生素D受体基因型及等位基因频率

2.2 维生素D受体FokⅠ位点PCR扩增产物电泳图 所有PCR扩增产物在电泳图上均显示单一条带。其中，目的基因扩增片段长度约270 bp，说明PCR产物没有较大的插入或缺失(见图1)。

2.3 维生素D受体FokⅠ位点PCR扩增产物酶切后电泳图 见图2。

M道：分子量标记Marker；6道：空白道

图1 维生素D受体FokⅠ位点扩增产物电泳图

M道：分子量标记Marker；1、3道：等位基因Ⅰ/Ⅰ纯合子；2、4、5道：等位基因Ⅰ/Ⅱ纯合子；6、7道：等位基因Ⅱ/Ⅱ纯合子

图2 TNF-α-308 PCR扩增产物酶切后电泳图

3 讨 论

牙周炎是牙周支持组织(牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质)发生的炎性疾病。文献报道[1]，我国糖尿病患者接近7 000万人，其中多以Ⅱ型糖尿病为主。研究发现[2]：其病因为致病微生物及其释放的毒素引起机体免疫失衡，而在机体免疫应答过程中产生的细胞因子对疾病的发生尤为重要。目前，越来越多的科研人员对于牙周炎与糖尿病之间的发病关系做了大量工作，而炎性反应亦是糖尿病发生、发展的重要病理机制之一[3]。

近年来，流行病学研究也越来越被广泛认可，学者们通过对2型糖尿病患者的流行病学调查，发现个体差异在牙周炎的发病过程中产生重要作用[4]。研究表明[5]，通过检测人群中等位基因的携带频率，进而查明与疾病发展相关的不同等位基因，这对于预测疾病相关的等位基因特性产生重要作用。大量文献报道，遗传基因在疾病发生过程中发挥了重要作用，认同基因序列与牙周病及糖尿病之间存在着明显的因果关系。

研究人员发现[6-7]，维生素D受体在维生素D表达过程中产生了重要作用，其中1,25-二羟胆骨化醇是一种基因转录调节蛋白，可增强单核细胞的吞噬作用，在机体的钙磷平衡、内分泌等方面起到重要作用。国内外学者证实[8-9]，慢性牙周炎与血液中维生素D水平普遍较低。而毛琳等[10]通过研究表明，维生素D在Ⅱ型糖尿病患者血液中含量偏低。因此，本研究通过对维生素D受体基因型的检测分析，分析维生素D受体在2型糖尿病伴重度慢性牙周炎中的携带频率，进而查找维生素D受体在Ⅱ型糖尿病伴重度慢性牙周炎患者的发病过程中的可能存在关系。

本实验结果显示：维生素D受体基因FokⅠ位点与2型糖尿病伴重度慢性牙周炎存在相关性。其中，2型糖尿病伴重度慢性牙周炎组FokⅠ位点Ⅱ/Ⅱ纯合子基因型携带频率为23.68%，Ⅱ型等位基因携带频率为43.42%；而在对照组中FokⅠ位点Ⅱ/Ⅱ纯合子基因携带频率为6.67%，Ⅱ型等位基因携带频率为13.33%。统计学分析显示，组间等位基因携带频率有统计学意义(χ2=14.481，P﹤0.01)，基因携带频率亦有统计学意义(χ2=13.481，P﹤0.05)。经组间比较，对照组与重度慢性牙周炎组的等位基因携带频率有统计学意义；对照组与Ⅱ型糖尿病伴重度慢性牙周炎组在基因型、等位基因携带频率方面均有统计学意义；其余组间比较无统计学意义。因此，维生素D受体FokⅠ位点与重度慢性牙周炎、Ⅱ型糖尿病伴重度慢性牙周炎存在相关性，是促进牙周炎发生发展的危险因素。

通过本次实验，可以得出维生素D的表达与Ⅱ型糖尿病伴重度慢性牙周炎的发生发展存在高度相关性，通过有效提高血液中维生素D的含量，对于两者的治疗可发挥重要作用。

[1] 孔京慧,肖林生.白细胞介素6及其基因多态性与2型糖尿病(综述)[J].医学综述，2009，15(19),2991-2993.

[2] Martelli FS，Martelli M，Rosati C，et al. Relevance in dental practice[J].Clin Cases Miner Bone Metab，2014，11:15-19.

[3] Hu FB，Meigs JB,Li TY,et al,Inflammatory marker8 and risk of developing type 2 diabetes in women[J].Diabetes,2004,53(3):693-700.

[4] Van Dy,Ke TE,Sheilesh D.Risk faetors for periodontitis[J].J Int Acad Periodontol,2005,7(1):3-7.

[5] Kinane DF，Shiba H，Hart TC.The genetic basis of periodontitis[J]. Periodontol,2005,39:91-117.

[6] El Jilani MM，Mohamed AA，Zeglam HB,et al.Association between vitamin D receptor gene polymorphisms and chronic periodontitis among Libyans[J]. Libyan J Med，2015，10:26771.

[7] Tsugawa N. Clinical Pharmacokinetics of Active Vitamin D3 and its derivatives，and Vitamin K2(Menatetrenone)[J]. Clinical Calcium，2016，26(11):1547-1558.

[8] 仝春实,邹永巍,王雷,等.维生素D及其与牙周炎的关系[J].国际口腔医学杂志,2014,41(4):474-477.

[9] Karasneh JA，Ababneh KT，Taha AH，et al. Association of vitamin D receptor gene polymorphisms with chronic and aggressive periodontitis in Jordanian patients[J]. Eur J Oral Sci，2013，121:551-558.

[10] 毛琳,李莉.2型糖尿病患者血清维生素D水平及其影响因素[J].中国医科大学学报,2017,46(1):68-71，74.