飞行时间质谱技术鉴定丝状真菌的研究进展

张敬霞，曲 芬

侵袭性真菌感染是重症监护和器官移植患者死亡的高风险因素[1]，其早期诊治对提高救治率至关重要。其中，丝状真菌是侵袭性真菌感染的主要病原菌之一，但丝状真菌生长缓慢（一般需要5～7 d）限制了早期诊断[2-3]，丝状真菌的早期鉴定与耐药性增强已成为临床救治的重大难题[4]。目前，丝状真菌常用的鉴定方法为镜检和菌落形态联合鉴定，但不足之处是易受检验人员主观判断影响。分子生物学方法虽是“金标准”，但其操作繁琐且对实验室条件和操作人员的技术水平要求较高，不适合常规开展[2]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser-desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）技术可以通过检测真菌中固有的特异性蛋白形成的特征性图谱从而实现对真菌菌种快速、准确的鉴定[5-7]，对于指导临床抗生素使用非常重要[3]。本文从技术原理、标本前处理、鉴定效果及影响因素等方面对MALDITOF MS技术鉴定丝状真菌的研究进展作一综述。

1 MALDI-TOF MS技术的鉴定原理

MALDI-TOF MS技术是近几年发展起来的，用于临床分离病原菌全细胞鉴定的软电离技术，其主要是针对菌种特异性核糖体蛋白进行检测，具有操作简单、快速、准确等优点。MALDI-TOF MS主要由MALDI和TOF两部分组成。MALDI技术的工作原理：激光照射样品蛋白与过饱和的基质溶液形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量并与样品蛋白解吸附使样品电离，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，从而使生物分子电离。TOF的工作原理：不同质荷比（m/z）的离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的时间不同，获得细菌特异的质谱指纹峰图。将该峰图与标准数据库图谱进行比对，根据匹配结果进行判读。分值越高，匹配效果越好，准确度越高。鉴定结果的评分范围0～3.0，数值＞2.0表明鉴定结果可达到菌种水平，1.7～2.0表明鉴定结果仅达到菌属水平，＜1.7为未达到菌属水平，结果不可信。由于微生物菌种或菌属存在不同程度的种内差异，如核苷酸顺序、生化反应、指纹图谱类型等，因此，数据库指纹图谱应该足够全面以确保覆盖菌种内的天然差异。

2 MALDI-TOF MS技术鉴定丝状真菌的前处理

丝状真菌的鉴定准确性较差，且由于细胞壁厚和形态特征变化大，诊断方法一直难以突破[2]。MALDI-TOF MS技术鉴定丝状真菌基本步骤包括点靶、前处理、上机，其中难度最大的是丝状真菌的前处理，即破壁。前处理也是影响丝状真菌鉴定效果的主要因素。丝状真菌细胞壁厚，为100～200 nm，且细胞壁的韧性和稳定性都较强，普通的前处理方式难以奏效。Vermeulen等[8]分析了MALDI-TOF MS技术鉴定完整丝状真菌细胞和裂解后细胞的效果，结果显示，细胞裂解法明显优于完整细胞法。

De Carolis等[9]通过对103株丝状真菌（曲霉菌、镰刀菌、毛霉目菌）运用真菌孢子和水混合直接点靶的完整细胞法处理，使用MALDI-TOF MS技术进行鉴定，发现94株已知菌中，91株能鉴定到菌种水平。同样，Nenoff等[10]使用完整细胞法对285株皮肤真菌（红色毛癣菌、毛孢子菌等）的研究显示，78.2%的丝状真菌可以鉴定到菌种水平。

细胞裂解法目前主要包括磁珠破碎法、海沙/丙酮-乙醇/甲酸乙腈提取法和旋转培养法等。磁珠破碎法的优点在于可以对丝状真菌充分研磨从而达到破壁效果，缺点在于操作比较繁琐。2008年Hettick 等[11]运用磁珠破碎法对12株青霉菌样本进行分析，结果显示，该方法对青霉菌鉴定的准确率达到100%。此外，12株曲霉菌属和5株不同的黄曲霉菌的鉴定结果表明其可以达到菌种水平的准确鉴定[12]。该方法具有很高的重复性，Lau等[13]采用磁珠破碎法对421株固体培养基上生长的丝状真菌鉴定，结果显示，菌种和菌属的鉴定准确性分别达到370（88.9%）株和388（93.2%）株。

另外一种破壁的方式是甲酸乙腈前处理，也是临床实验室最常用的方法。 Schrödl等[14]对41株不同的横梗霉进行甲酸乙腈提取法处理，实现了在菌种水平100%的准确鉴定率。Bille等[15]在甲酸乙腈提取法的基础上进行了简化，将64株曲霉菌的孢子或菌丝与靶板上甲酸乙腈（1 μl 70%）预混后对细胞进行裂解，使用该裂解方法检测准确率可以达到86%，与Iriart 等[16]应用甲酸乙腈提取法鉴定44株曲霉菌的效果（81.1%）相当，甲酸乙腈提取方法同样适用于丝孢菌属、镰刀菌属、横梗霉菌属和皮肤癣菌的鉴定[8，17]。

最后一种方式是旋转培养法，该方法可以得到均一的菌丝体，有利于丝状真菌细胞壁的破坏。黄艳飞等[18]运用旋转培养法对380株丝状真菌培养鉴定，其鉴定菌属和菌种的准确率分别为94.0%和76.0%。因此，实验室在鉴定丝状真菌时可以根据自身实验室条件和实验需要选择合适的前处理方法，从而达到满意的鉴定结果。

3 MALDI-TOF MS技术鉴定丝状真菌的效果

近年来，MALDI-TOF MS技术对丝状真菌快速鉴定的研究逐渐增加，鉴定的丝状真菌种类也在增多。Ranque等[19]选取了58种共625株丝状真菌（毛癣菌、镰刀菌、木霉菌和毛霉目菌等），应用传统方法和MALDI-TOF MS技术同时鉴定，菌种水平鉴定准确率分别为80%和89%。对于非曲霉类的丝状真菌，MALDI-TOF MS技术的鉴定准确率较传统方法提高了31%～61%。MALDITOF MS技术对以下丝状真菌鉴定效果较好，包括曲霉菌、青霉菌、毛癣菌、镰刀菌、木霉菌和毛霉目菌，其中对曲霉菌的鉴定效果最好，鉴定准确率可以达到98.4%[19]，与Bile等[15]的鉴定效果相当（98.4%）。Chen等[20]也使用MALDITOF MS技术成功识别了6种青霉菌属菌株。De Carolis等[9]通过103株丝状真菌（曲霉菌、镰刀菌、毛霉目菌）质谱鉴定对MALDI-TOF MS技术进行评估，发现94株已知菌中，91株能鉴定到菌种水平，其余3株鉴定到菌属水平。

MALDI-TOF MS技术对少见丝状真菌也可以达到较好的鉴定效果，Lau等[13]通过甲酸乙腈提取技术对421株固体培养基上生长的包括76个菌属和152个菌种的丝状真菌（其中涵盖了少见丝状真菌，包括茎点霉、尖端赛多孢、疣状瓶霉、担子类菌、球毛壳菌等）进行鉴定，然后在菌种水平鉴定出370株（88.9%），在菌属水平鉴定出388株（92.2%），33株鉴定结果不可信，其中8株青霉菌不在菌种数据库中，其余25株为与临床疾病无关的担子菌。因此，根据临床需要，MALDI-TOF MS技术须要不断扩充并完善质谱数据库。

4 MALDI-TOF MS技术鉴定丝状真菌的影响因素

MALDI-TOF MS技术鉴定丝状真菌的影响因素包括取材部位、指纹图谱数据库及提取方法等。

4.1 取材部位 根据丝状真菌的菌落特征分为孢子和菌丝两个部位，二者鉴定效果不同，由于丝状真菌孢子细胞壁比较厚，孢子壁不易溶解导致蛋白析出困难[16]，因此丝状真菌的鉴定最好选用菌丝部位。Welham等[21]在2000年首次报道了用MALDI-TOF MS技术鉴定青霉菌、双间柱顶孢霉菌及红色毛癣菌的孢子，由于真菌孢子破壁困难，结果仅获取到少量波峰。同年Li等[22]对黄曲霉、米曲霉、寄生曲霉及酱油曲霉的孢子进行研究，结果表明产黄曲霉素菌株和非产黄曲霉素菌株具有不同的质谱波峰图，该方法同样适用于曲霉菌、和镰刀菌属的鉴定[23-25]。菌丝部位细胞壁较孢子部位薄，破壁效果相对较好，Li等[26]对381株曲霉菌的菌丝进行鉴定，结果发现，无论分值如何变化，MALDI-TOF MS技术的鉴定准确率都可以达到89.0%。同样，Lau等[13]对421株丝状真菌的菌丝的研究中鉴定准确率也达到了93.2%。

4.2 指纹图谱数据库 MALDI-TOF MS技术中完整的真菌指纹图谱数据库是保证鉴定结果准确的基础。值得注意的是，不同菌种之间甚至在同种真菌不同菌株之间，真菌细胞壁和孢子的组成也呈现出定性和定量的差异[11]。因此，鉴定结果取决于指纹图谱数据库中某一菌种的菌株数量，但De Carolis 等[9]研究发现，临床分离的丝状真菌鉴定通常与数据库中很少（或甚至1个）的参考图谱比对。除了Bille等[15]和 Iriart等[16]运用了Andromas和Vitek MS数据库进行鉴定外，其他研究者均在上述两种数据库基础上对数据库进行了扩增。鉴定错误的实验研究往往是因为参考的指纹图谱数据库不存在该菌质谱指纹图谱[8]。

此外，为了实现同种菌种不同菌龄的准确鉴定，Alanio 等[27]运用了一个由新生菌落和成熟菌落作为参考菌株的指纹图谱，并建立了特定物种的指纹图谱数据库，然后用124株临床曲霉菌和16株环境曲霉菌对指纹图谱数据库进行了测试，结果鉴定准确率达到了98.6%（138/140），特异度达到了100%，该数据库可以鉴定不同成熟度的菌落。在Alanio研究的基础上，De Carolis等[9]建立了一个大型的与临床丝状真菌相关的数据库用于MALDI-TOF MS技术对物种的分析。数据库的指纹图谱来自于109株菌种的新生和成熟菌落，其中涵盖了55种丝状真菌（33种曲霉菌、12种镰刀菌、10种毛霉目菌）。进一步用103株丝状真菌评估这个数据库，通过分子测序的方法对MALDI-TOF MS技术鉴定结果的可靠性进行评定。除了数据库没有包含的9株丝状真菌外，MALDI-TOF MS技术对菌种水平的准确鉴定率达到了96.8%（91/94），其余3株仅鉴定到了菌属的水平 。为了增加指纹图谱数据库中菌种的涵盖面，Lau等[13]进一步建立了一个综合性的数据库（294株丝状真菌分离株包括76个菌属和152个菌种），当用421株临床分离真菌来对这个数据库进行评估时，数据达到了菌种水平和菌属水平的精准鉴定，其鉴定准确率分别为370株（88.9%）和388株（93.2%）。

扩充数据的研究在近几年逐渐增加，并且均取得了满意的鉴定效果。2017年西班牙一个实验室用390株曲霉菌对自建数据库做了验证分析，其中95.5%达到了菌种水平，4.5%达到了菌属水平[28]。同样，Triest等[29]在对自建数据库的研究中获得了91%的菌种鉴定率，因此，实验室自建数据库具有更好的特异性和准确性，不断完善质谱数据库是实现MALDI-TOF MS技术快速、准确鉴定丝状真菌的有力保障。

4.3 提取方法 为了优化MALDI-TOF MS技术对丝状真菌的常规鉴定方法，Cassagne 等[30]制定了一个详细的鉴定程序，用沙保弱-庆大-氯霉素琼脂对丝状真菌进行培养，用甲酸乙腈提取丝状真菌菌落，丝状真菌鉴定到菌种水平的准确率达到87%。鉴定失败的菌株是由于数据库中不存在对应的质谱指纹图谱，1株白僵菌未能鉴定出结果和1株米根霉菌错误鉴定成了卷枝毛霉菌。Coulibaly等[31]在对甲酸乙腈和三氟乙酸2种提取方法进行比对时发现甲酸乙腈提取效果和三氟乙酸的提取效果相似，但是甲酸乙腈提取法具有更快、毒性更小等优点。Alanio 等[27]在之前的研究成果之上制定了一个简单快速的鉴定方案：直接用丝状真菌的孢子、分生孢子、菌丝混合在水中，然后将水混合物点靶。研究显示，直接点靶技术也可以得到质谱指纹图谱[32]。Park等[33]在用甲酸乙腈提取蛋白的方法对345株曲霉菌鉴定的研究中，菌种的鉴定率达到了94.5%（326/345），菌属鉴定率达到了98.8%（341/345）。虽然甲酸乙腈提取蛋白的实验方法可以获得较好的结果[13]，但是当蛋白提取方法被广泛用于丝状真菌质谱鉴定的时候，显现出一个重要的问题：孢子产生的气溶胶会对实验室产生潜在的感染或者污染，故整个活菌的操作过程必须在生物安全柜内进行，且不能同时进行多种真菌的操作，以免交叉污染。

4.4 其他影响因素 为了获得均一的菌丝从而得到更加清晰的质谱图谱，布鲁克公司在建立单独的丝状真菌数据库时采用了沙保弱液体培养基培养丝状真菌[11]。虽然液体培养法减少了培养条件的影响并且可以获得均一的菌丝体，同时也减少大多数菌种色素和次代谢物的产生[30]。但是该方法很少用于临床真菌实验室，因为它存在雾化孢子污染的风险以及无法显现表型的宏观和微观特征[34]。

另外，液体培养难以检测到污染或与其他霉菌共同的感染。固体培养丝状真菌不仅在临床真菌实验室广泛使用，而且易于检测到污染。收集丝状真菌样本时，固体培养基比液体培养基在制备过程上更加简化，节省时间[34-35]。评分标准对鉴定结果具有至关重要的作用，Li等[26]对381株的曲霉菌的研究发现，当菌种的评分临界值从≥2.0改为≥1.7时，菌种鉴定率就从30.2%上升到了79.5%；因此，在鉴定曲霉菌的时候可以降低BURKER的评分标准。由于丝状真菌的生长条件（时间、温度、培养基）的改变会影响它的形态特征，因此，Zhou等[36]在52株烟曲霉的研究中发现，培养时间（48、72、96、120 h）对质谱鉴定效果的影响具有统计学意义，其中培养48 h的鉴定效果较其他3组差。但研究发现无论是生长在沙保弱液体培养基、沙保弱琼脂培养基还是Chalet琼脂培养基的烟曲霉，对质谱鉴定效果的影响均无统计学意义；同样，培养温度28 ℃和35 ℃对鉴定效果亦无影响。MALDI-TOF MS技术鉴定丝状真菌影响因素较多，因此条件探索仍须做进一步研究。

5 MALDI-TOF MS技术鉴定丝状真菌的展望

MALDI-TOF MS技术操作简单、成本低廉、鉴定准确、鉴定周期短，在全世界应用越来越广泛，并将逐渐取代传统的鉴定方法。由于丝状真菌存在种类繁多，破壁困难，易污染及影响因素多等诸多问题，故找到优化条件，制定统一的操作规范，提高MALDI-TOF MS技术鉴定丝状真菌的能力还有待继续研究，并且丝状真菌的数据库还须要不断完善，鉴定方法和培养时间也须要做进一步的探索和研究。实验室可以结合自身特点，建立个性化数据库，从而提高鉴定的阳性率和准确率。随着研究的不断深入，经验的逐步积累，相信MALDI-TOF MS技术在临床实验室丝状真菌的快速鉴定中会发挥越来越重要的作用。

【参考文献】

[1]Del Chierico F,Masotti A,Onori M,et al.MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin[J].J Proteomics,2012,75(11):3314-3330.

[2]王欢，贾天野，鲍春梅，等.质谱仪在真菌鉴定中的应用与评价[J].传染病信息，2015，28(4):210-214.

[3]Lackner M,Hoog GSD,Verweij PE,et al.Species-specifi an cantifungal susceptibility patterns of scedosporium and pseudallescheria species[J].Antimicrobial Agents＆Chemotherapy,2012,56(5):2635-2642.

[4]Ostrosky-Zeichner L.Invasive mycoses: diagnostic challenges[J].Am J Med,2012,125(Suppl 1):S14-S24.

[5]Kliem M,Sauer S.The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics[J].Curr Opin Microbiol,2012,15(3):397-402.

[6]Chalupova J,Raus M,Sedlarova M,et al.Identification of fungal microorganisms by MALDI-TOF mass spectrometry[J].Biotechnol Adv,2014,32(1):230-241.

[7]Patel R.MALDI-TOF MS for the diagnosis of infectious diseases[J].Clin Chem,2015,61(1):100-111.

[8]Vermeulen E,Verhaegen J,Indevuyst C,et al.Update on the evolving role of MALDI-TOF MS for laboratory diagnosis of fungal infections[J].Current Fungal Infection Reports,2012,6(3):206-214.

[9]De Carolis E,Posteraro B,Lass-Flörl C,et al.Species identification of Aspergillus,Fusarium and Mucorales with direct surface analysis by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Clin Microbiol Infect,2012,18(5):475-484.

[10]Nenoff P,Erhard M,Simon JC,et al.MALDI-TOF mass spectrometry-a rapid method for the identification of dermatophyte species[J].Med Mycol,2013,51(1):17-24.

[11]Hettick JM,Green BJ,Buskirk AD,et al.Discrimination of Penicillium isolates by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry fingerprinting[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2008,22(16):2555-2560.

[12]Hettick JM,Green BJ,Buskirk AD,et al.Discrimination of Aspergillus isolates at the species and strain level by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry fingerprinting[J].Anal Biochem,2008,380(2):276-281.

[13]Lau AF,Drake SK,Calhoun LB,et al.Development of a clinically comprehensive database and a simple procedure for identification of molds from solid media by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J].J Clin Microbiol,2013,51(3):828-834.

[14]Schrödl W,Heydel T,Schwartze VU,et al.Direct analysis and identification of pathogenic Lichtheimia species by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight analyzer-mediated mass spectrometry[J].J Clin Microbiol,2012,50(2):419-427.

[15]Bille E,Dauphin B,Leto J,et al.MALDI-TOF MS Andromas strategy for the routine identification of bacteria,Mycobacteria,yeasts,Aspergillus spp.and positive blood cultures[J].Clin Microbiol Infect,2012,18(11):1117-1125.

[16]Iriart X,Lavergne RA,Fillaux J,et al.Routine identification of medical fungi by the new Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight system with a new time-effective strategy[J].J Clin Microbiol,2012,50 (6):2107-2110.

[17]Alshawa K,Beretti JL,Lacroix C,et al.Successful identification of clinical dermatophyte and Neoscytalidium species by matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J].J Clin Microbiol,2012,50(7):2277-2281.

[18]黄艳飞，常峥，白婕，等.丝状真菌质谱鉴定前处理方法及应用[J].中华医学杂志，2017，30(13):2379-2383.

[19]Ranque S,Normand AC,Cassagne C,et al.MALDI-TOF mass spectrometry identification of filamentous fungi in the clinical laboratory[J].Mycoses,2014,57(3):135-140.

[20]Chen HY,Chen YC.Characterization of intact Penicillium spores by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2005,19(23):3564-3568.

[21]Welham KJ,Domin MA,Johnson K,et al.Characterization of fungal spores by laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2000,14(5):307-310.

[22]Li TY,Liu BH,Chen YC.Characterization of Aspergillus spores by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2000,14(24):2393-2400.

[23]Valentine NB,Wahl JH,Kingsley MT,et al.Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2002,16(14):1352-1357.

[24]Chen HY,Chen YC.Characterization of intact Penicillium spores by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2005,19(23):3564-3568.

[25]Kemptner J,Marchetti-Deschmann M,Mach R,et al.Evaluation of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) preparation techniques for surface characterization of intact Fusarium spores by MALDI linear time-of-flight mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2009,23(6):877-884.

[26]Li Y,Wang H,Zhao YP,et al.Evaluation of the Bruker Bioytyper matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry system for identification of Aspergillus species directly from growth on solid agar media[J].Front Microbiol,2017,8:1209.

[27]Alanio A,Beretti JL,Dauphin B,et al.Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry for fast and accurate identification of clinically relevant Aspergillus species[J].Clin Microbiol Infect,2011,17(5):750-755.

[28]Vidal-Acuña MR,Ruiz-Pérez de Pipaón M,Torres-Sánchez MJ,et al.Identification of clinical isolates of Aspergillus,including cryptic species,by matrix assisted laser desorption ionization timeof-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)[J].Med Mycol,2017.

[29]Triest D,Stubbe D,De Cremer K,et al.Use of matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry for identification of molds of the Fusarium genus[J].J Clin Microbiol,2015,53(2):465-476.

[30]Cassagne C,Ranque S,Normand AC,et al.Mould routine identification in the clinical laboratory by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry[J].PLoS One,2011,6(12):e28425.

[31]Coulibaly O,Marinach-Patrice C,Cassagne C,et al.Pseudallescheria/Scedosporium complex species identification by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Med Mycol,2011,49(6):621-626.

[32]Santos C,Paterson RR,Venâncio A,et al.Filamentous fungal characterizations by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J].J Appl Microbiol,2010,108(2):375-385.

[33]Park JH,Shin JH,Choi MJ,et al.Evaluation of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-fight mass spectrometry for identification of 345 clinical isolates of Aspergillus species from 11 Korean hospitals: comparison with molecular identification[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2017,87(1):28-31.

[34]Lau AF,Drake SK,Calhoun LB,et al.Development of a clinically comprehensive database and a simple procedure for identification of molds from solid media by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J].J Clin Microbiol,2013,51(3):828-834.

[35]Cassagne C,Normand AC,L'Ollivier C,et al.Performance of MALDI-TOF MS platforms for fungal identification[J].Mycoses,2016,59(11):678-690.

[36]Zhou L,Chen Y,Xu Y.Performance of VITEK mass spectrometry V3.0 for rapid identification of clinical Aspergillus fumigatus in different culture conditions based on ribosomal proteins[J].Infect Drug Resist,2017,10:499-506.