自身免疫性肝病抗原抗体研究及临床意义

赵丹彤，闫惠平

自身免疫性肝病（autoimmune liver disease,AILD）是一组病因未明的由于自身免疫反应造成肝胆系统损伤的慢性进展性肝脏疾病，主要包括自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis,AIH）、原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis,PBC）和原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis,PSC）。不同类型的AILD有不同特征的自身抗体，自身抗原和抗体不仅在发病机制中发挥作用，而且还有重要的临床价值。本文就AILD相关抗原抗体的研究进展及临床意义作一综述。

1 自身免疫性肝炎

AIH是一种慢性炎症性肝病，主要影响女性，以高 γ-球蛋白血症，血液循环中存在自身抗体为特征，与人类白细胞抗原HLA-DR3或DR4相关，肝组织学表现为界面性肝炎，对免疫抑制剂治疗应答有效。

1.1 抗核抗体（antinuclear antibody,ANA）、抗平滑肌抗体（anti-smooth muscle antibody,ASMA） 高滴度ANA和ASMA阳性是1型AIH的主要标志[1]，但这些抗体并非疾病特异性抗体。ANA相应的靶抗原包括组蛋白、双链DNA、核染色质和核糖核蛋白复合物等，抗原谱有较大的异质性，临床常用免疫印迹或ELISA法检测ANA靶抗原对应的自身抗体[2]。采用间接免疫荧光法检测时，AIH患者ANA在Hep-2细胞中的荧光模式多呈现为核均质型和核颗粒型以及多种核型之混合型。尽管AIH患者50%～70%表现为ANA阳性（在我国报告检出率更高），但迄今为止，未能确定AIH具有特异性的ANA靶抗原。ASMA靶抗原为包括F肌动蛋白、G肌动蛋白在内的多种细胞骨架分子，抗肌动蛋白抗体在AIH患者中的阳性率约为41%。Healey等[3]通过一项回顾性研究发现，ASMA阳性但ALT正常的AIH患者并不常见，但ASMA阳性且ALT升高（＞55 IU/L）的患者应密切随访，因二者对AIH诊断的阳性预测值可达22%。

1.2 抗肝肾微粒体抗体-1（anti-liver-kidney microsomal antibody,抗-LKM-1）和抗肝细胞溶质抗体-1（antiliver cytosol type 1 antibody,抗-LC-1） 抗-LKM-1和抗-LC-1是2型AIH的诊断标志。2型AIH主要累及儿童和青少年，较1型少见。抗-LKM-1的主

要靶抗原为细胞色素P4502D6（CYP2D6），其可在肝细胞浆膜表达，抗-LKM-1可能通过补体激活途径或抗体依赖细胞介导的细胞毒作用致肝细胞损伤。CYP2D6与HCV等病毒抗原序列有同源性，因此某些HCV感染者可出现抗-LKM-1[4]。携带某种特定人类白细胞抗原（HLA-DRB7*07）的患者可通过分子模拟机制对AIH易感[5]。抗-LC-1的靶抗原为亚胺甲基转移酶-环脱氨酶（formiminotransferase cyclodeaminase,FTCD），抗-LC-1可以单独存在，但常与抗-LKM-1同时出现。在10%的2型AIH患者中抗-LC-1是惟一可检测到的自身抗体，且与AIH疾病活动度和进展有关。Yuksel等[6]用编码CYP4502D/6和FTCD融合蛋白的DNA质粒免疫HLA-DR3转基因小鼠，成功构建出拟人化AIH动物模型，该模型更接近人类AIH且有肠道菌群多样性减少的特征，为阐明AIH发病机制及评估免疫治疗有效性和安全性提供了有效的工具。

1.3 抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体（anti-soluble liver antigen/liver-pancreas,抗-SLA/LP） 抗-SLA/LP在AIH患者中的阳性率为20%～30%，是目前已知惟一的AIH特异性自身抗体，诊断特异性近100%，通常预示患者病情严重且预后不良[7]。该抗体通常与抗-Ro52相关，具有较高的检测一致性[8-9]。抗-SLA/LP的靶抗原为SepSecS，是一种将O-磷酰基-tRNA（Sep）转化为硒半胱氨酸基-tRNA（Sec）的合酶。本团队研究发现，中国AIH患者存在6条可被CD4+T细胞识别的SLA表位肽，通过TH1途径参与AIH发病机制[10]。

1.4 抗去唾液酸糖蛋白受体抗体（anti-asialoglycoprotein receptor,抗-ASGPR） ASGPR是一种C型凝集素，主要表达在肝细胞膜上，负责清除去唾液酸糖蛋白、循环系统中的IgA、凋亡细胞、脂蛋白以及活化的淋巴细胞等。ASGPR是与AIH密切相关的肝特异性膜脂蛋白的组分之一。抗-ASGPR主要发现于AIH患者，据报道在1型AIH患者中阳性率可达75%～82%；在疾病活动期、诊断初期及未进行激素治疗的患者中检出率最高，而在免疫抑制治疗的过程中，该抗体水平可迅速下降[11]。由于该抗体特异性并不高，因此国内外相关学会并未将其写入AIH临床实践指南[1，12]。

1.5 其他AIH相关抗体新进展 本团队前期采用二维凝胶电泳和质谱分析等方法，对AIH血清进行了差异蛋白鉴定，发现了延胡索酸水合酶（fumarate hydratase,FH）、磷酸甘油变构酶-B（phosphoglycerate mutase isozyme B,PGAM-B）、3-磷酸甘油酸脱氢酶（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase,PHGDH）等值得关注的蛋白抗原[13]，并对其中两种抗原进行了克隆表达纯化，发现AIH患者存在抗-FH和抗-PHGDH，提示它们对AIH可能具有诊断价值[14]。随后，对117例各类肝病患者进行了抗-PHGDH检测，其中40例AIH患者中抗-PHGDH阳性12例，阳性率为30.7%，高于其他肝病对照组，该抗体有助于AIH诊断和鉴别诊断[15]。此外，本团队采用商品化FH蛋白作为抗原建立间接ELISA法，对230例各类肝病患者及98例健康志愿者血清进行了抗-FH检测，在88例AIH患者中抗-FH的阳性率为40.0%，显著高于其他肝病对照组和健康对照组，该抗体对AIH诊断灵敏度为40%，特异度为94%，也提示其为诊断AIH的新指标[16]。

蛋白芯片技术是近年发展起来的高通量蛋白组学技术，为自身免疫病相关自身抗体的筛选提供了新的技术手段。Zingaretti 等[17]采用1626种人重组蛋白芯片，从AIH患者血清中筛选出识别其中6种蛋白的抗体，其中针对表达在白细胞和肝细胞表面的IL4受体（CD124）III型纤连蛋白结构域靶抗原的抗体对AIH的灵敏度和特异度最高。值得关注的是，AIH患者血清可以阻止由IL4结合CD124所致的STAT6磷酸化，表明该抗体具有功能性中和IL4的效应，从而参与AIH发病机制。

肝移植术后新发AIH是近年关注的一个热点，但无高-γ球蛋白血症一直是其诊断难点。Clemente等[18]在1例肝移植术后7年发生AIH的9岁男孩体内发现了一种针对CYP-2C19抗原的新型抗肝细胞微粒体抗体，而患者血清γ球蛋白水平一直正常。该发现为研究同种异体肝移植导致AIH的自身免疫应答提供了新的视角，并提出采用人类组织而不是动物组织进行自身抗体检测可能更有助于新发AIH的诊断。

2 原发性胆汁性胆管炎

PBC又称原发性胆汁性肝硬化，是以肝内小胆管病变为主的一种AILD，病因尚不明确。抗线粒体抗体（anti-mitochondiral antibodies,AMA）是其临床诊断的重要标志物。PBC患者存在的自身抗体主要为两类：AMA类（包括AMA-M2亚型抗体等）及ANA类。PBC患者出现的ANA可能包括抗-spl00、抗-gp210、抗着丝点抗体、抗干燥综合征A抗原抗体／抗干燥综合征B抗原抗体等[19]。

2.1 AMA AMA分为M1～M9九个亚型，其中M2是AMA的主要亚型，是诊断PBC的标志性抗体，诊断特异性高达90%～95%，对PBC诊断、预后及无症状者随访有重要意义[20-22]。其主要靶抗原为丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基（E2 component of the pyruvate dehydrogenase complex,PDC-E2）。PDC-E2为线粒体内膜上的2-酮酸脱氢酶复合物一个成分，另外两种成分为酮戊二酸脱氢酶复合体E2亚基和丙酮酸脱氢酶复合体侧链E2亚基，3种组分的融合表达产物称为BPO。在这些酶组分中，80%～90%的M2特异性自身抗体靶抗原为PDC-E2，还有4%～13%的患者只针对其余两种组分。与采用天然PDC包被或仅包被BPO的ELISA检测系统相比，采用融合重组蛋白BPO与天然PDC纯化抗原混合作为包被抗原可提高PBC的检测敏感性[23]。

2.2 核点型ANA及核周型ANA 这两种ANA核型是欧洲肝病学研究会的PBC指南中所称的PBC特异性抗核抗体，我国PBC患者ANA主要核型除了核周型、核点型之外，还常见到着丝点型[24]。核点型ANA可进一步分为多核点型和少核点型，其靶抗原主要包括sp100（可溶性酸性磷酸化核蛋白）、sp140、早幼粒细胞型白血病抗原、微小泛素相关修饰因子等[25]。抗-sp100在PBC患者中的阳性率为30%，对PBC的诊断特异性＞95%，是AMA阴性PBC的辅助诊断指标。抗着丝点抗体与门静脉高压的发生相关。

核周型（又称核膜型）ANA，核膜主要由双核膜、板层素网和核孔复合物3种成分组成。其中核孔复合物包括相对分子量为210 kD的跨膜糖蛋白（gp210）和62 kD的p62跨膜蛋白。抗-gp210对PBC诊断具有高度特异性（＞95%），在PBC患者中的阳性率为8%～30%，是AMA阴性PBC的诊断指标，是发展为肝衰竭的危险因素[26]。

除抗-gp210、抗-sp100外，抗-p62、抗核板素B受体对AMA阴性PBC具有辅助诊断价值[21]，抗-SOX13、抗-SUMO-1、抗-SUMO-2在 PBC诊断中的价值也有报道[27]，但临床应用较少。

2.3 其他PBC相关抗体新进展 PBC患者血清还存在一种Hep2细胞染色呈胞浆斑点状荧光模式的抗体，所针对的靶抗原为mRNA加工小体（P小体），又称甘氨酸色氨酸包涵体简称GW小体。该抗体可见于5%～10%PBC患者，但与肝功能失代偿和Mayo评分无明显相关性[28]。

近年，国内外研究团队相继采用高通量蛋白芯片技术发现并鉴定了一些与PBC高度相关且敏感的特异性自身抗原[29-30]，主要包括HK1亚型1、HK1亚 型 2、KLHL12、KLHL7、ZBTB2和 EIF2C1。其中，HK1是一种位于线粒体外膜的己糖激酶；KLHL12位于细胞核内，负责胶原蛋白输出，与多巴胺D4受体和Dishevelled蛋白泛素化相关。抗-HK1和抗-KLHL12两种抗体联合检测对PBC诊断的特异性≥95%，敏感性高于抗-gp210和抗-sp100，两种抗体可在10%～35%的AMA阴性PBC患者中检测到，是PBC新的诊断标志物。

3 原发性硬化性胆管炎

PSC是一种以特发性肝内外胆管炎和纤维化导致多灶性胆管狭窄为特征，慢性胆汁淤积病变为主要临床表现的AILD，目前常通过磁共振造影及内径逆行造影进行诊断[31]。约半数以上的PSC患者血清中可检测到ANA、非典型核周型抗中性粒细胞胞浆抗体（perinuclear antineutrophil cytoplasmic antibodies,p-ANCA）、SMA、抗内皮细胞抗体、抗磷脂抗体等多种抗体，但一般为低滴度且对PSC无诊断特异性[32]。

ANCA在PSC患者中的阳性率可高达80%～94%，Hov等[33]对193例挪威PSC患者的研究表明，ANCA阳性率为80%，其中p-ANCA阳性率为70%。ANCA阳性患者比阴性患者更年轻且胆管癌阳性率较低；HLA-B*08是ANCA或p-ANCA阳性患者患PSC的危险因素；有消化性溃疡无肝病的p-ANCA阳性患者携带HLADRB1*03的比率较高，表明ANCA可能是区分PSC疾病亚型的标志物。

Jendrek等[34]发现，肠道对抗糖蛋白2抗体（抗-GP2）的天然免疫耐受缺失与PSC疾病进展相关。GP2蛋白是复杂性克罗恩病的典型抗体，属于胰腺抗体。IgA型抗-GP2可作为胆道疾病的新标志物，特别是PSC预后不良的危险因素及重症PSC分类的依据，指引了PSC靶向治疗方向。

总之，AILD发病机制仍未明确，相关自身抗体的研究仍在继续。不断发现和认识疾病特异性的自身抗原抗体谱，为我们了解AILD的发病机制、疾病分型、早期诊断，病程监测、评价疗效、预后判断提供了新的依据。

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