犁头草黄酮含量的测定与分离
2018-03-21谢娟平
谢娟平，党 鑫
(安康学院 秦巴中药资源研发中心，陕西 安康 725000)
1 材料与方法
1.1 材料与仪器试剂
犁头草分别采集于安康市佛坪镇、安康市汉滨区、渭南市、西安市等地。
紫外分光光度计UV-6100 PC(上海美普达仪器有限公司)；分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；超声波清洗器KH2200E型(昆山禾创超声仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱101-1AB型(天津市泰斯特仪器有限公司)；旋转蒸发仪RE-52AA(上海雅荣生化仪器设备有限公司)；循环水式真空泵SHR-Ⅲ(西安泰康生物科技有限公司)。
芦丁对照品(纯度99.9%，上海友思生物技术有限公司)；薄层层析硅胶(硅胶G，青岛海浪硅胶干燥剂厂)；羧甲基纤维素钠(AR，天津市科密欧化学试剂有限公司)；无水乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸乙酯、结晶氯化铝等试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 标准曲线
对照品溶液的制备。精确称量芦丁标准品20 mg，移至100 mL容量瓶中，70%乙醇定容，摇匀即得，备用[8]。
吸收波长的确定。取上述溶液70%乙醇稀释5倍，于UV-6100 PC紫外可见分光光光度计上在200～800 nm波长范围内扫描，得最大吸收波长为273 nm。
标准曲线的制备。取芦丁标液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别于25 mL容量瓶中，加入5 mL 0.1 mol·L-1的AlCl3乙醇溶液，加入70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置10 min，得一定浓度梯度的标准系列溶液。在273 nm波长处测定吸光度值[9-10]。分别以标准品的浓度及其相应的吸光度为横纵坐标制作标准曲线，得相应的回归线方程：A=0.034 5×C+0.005 5，R2=0.999 4，线性范围为0.8～24.0 μg·mL-1。
1.2.2 样品液制备
另外，公路养护单位还要加强对各项施工材料的控制力度，防止质量不达标的施工材料混入施工现场中。①沥青材料，该项材料为公路养护的核心材料，在采购沥青材料时，试验检验部门需要定期抽查，一旦发现质量不达标的沥青材料，禁止其进入到施工现场中，针对标号与产地各不相同的沥青材料，需要将其进行分类存储。②砂石与矿粉施工材料，检修人员可以结合《公路工程试验规程》条例，对砂石与矿粉等施工材料进行综合检测，对于检测合格的施工材料，还要妥善存放，加强各项施工材料的防潮与防腐蚀等[3]。
取不同产地及不同生长期犁头草，干燥，粉碎。分别精确称量2 g，置于不同烧杯中，加入75%乙醇溶液20 mL，超声提取30 min，称重，75%乙醇补足重量，过滤，取滤液2 mL于10 mL容量瓶中，加75%乙醇溶液定容至刻度线。
1.3 精密度试验
精确吸取1.2.2节下制备的安康市镇坪县犁头草样品溶液5份，每份0.5 mL，于25 mL容量瓶中加3 mL的0.1 mol·L-1AlCl3乙醇溶液，加70%乙醇定容，作为精密度试验样品溶液。取上述溶液于273 nm测定吸光度值，计算黄酮含量。
1.4 稳定性试验
精确吸取1.2.2节下制备的安康市镇坪县犁头草样品溶液5份，每份0.5 mL，于25 mL容量瓶中同1.3节下操作，制备稳定性试验样品溶液。分别于0，10，20，30，40 min时在273 nm处测定吸光度值，计算黄酮含量。
1.5 样品检测
取1.2.2节下制备的安康市镇坪县、安康市汉滨区、渭南市、西安市、四川省广元市犁头草样品溶液，每份0.5 mL，于25 mL容量瓶中同1.3节下操作，制备样品溶液，分别测定吸光度。代入A=0.034 5C+0.005 5中计算黄酮含量，比较不同产地及不同生长期犁头草总黄酮含量。
1.6 分离纯化
取安康市镇坪县犁头草，60 ℃干燥，粉碎，称取1 000 g，加75%乙醇适量使粉末湿润膨胀24 h，装入渗漉桶中，加5倍量75%乙醇渗漉，收集渗漉液约40 L[11-13]。以上渗漉液平分为2份，1份减压回收干燥并称量备用，1份用来做系统分离。在最大吸收波长处测定吸光度值，计算犁头草渗漉液中的总黄酮量。
用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对犁头草渗漉液依次萃取，得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液及水溶液部分，减压干燥，得各萃提产物，按1.2.2节下方法制备供试液并按1.3节下操作测定吸光度，计算各萃取部分的总黄酮含量[12]。
2 结果与分析
2.1 精密度和稳定性
由表1可知，按1.3节操作测定的黄酮含量为50.471 mg·g-1，相对标准差(RSD)为1.438%，表明方法的精密度良好。按1.4节下操作测定不同时间下样品黄酮含量平均值为50.485 mg·g-1，RSD为0.863%，表明稳定性良好。
表1 方法学的试验结果
2.2 黄酮含量
由表2可知，安康市镇坪县的犁头草中总黄酮含量高达50.98%(故以此作为分离纯化的原料)，且从3—5月生长期内，犁头草中总黄酮含量呈增加趋势。
表2 不同产地及生长期犁头草中的黄酮含量
2.3 分离纯化
2.3.1 提取
取1.6节下渗漉液20 L(相当于原药材500 g)，按1.5节下方法在273 nm处测定吸光度值，代入回归方程计算渗漉液黄酮浓度为0.918 1 mg·mL-1，相当于原药材黄酮含量为36.724 mg·g-1(提取液含量为50.98 mg·g-1)，可知75%乙醇渗滤法提取犁头草中的黄酮类物质的保留率为72.89%。渗漉液干燥共得粗提取物112.6 g，计算粗提物黄酮含量为16.31%。
2.3.2 系统分离
按1.6节下操作，进行分离纯化，分别测定乙酸乙酯萃取部分、正丁醇萃取部分及水溶液部分黄酮含量得到各萃取物部分黄酮总量。各萃取液浓缩干燥，得萃取物总量，如表3所示。
表3 各分离纯化萃提物的黄酮含量
表3表明，乙酸乙酯萃取物中黄酮类物质的含量高达73.42%，说明犁头草中的黄酮类成分主要富集在乙酸乙酯中，可选择乙酸乙酯部分作为进一步分离纯化及开发的主要原料。
3 小结
本文以芦丁为对照品，0.1 mol·L-1的AlCl3乙醇溶液为显色剂，运用紫外分光光度法在273 nm处测定了犁头草中的总黄酮含量。精密度试验结果RSD为1.438%，说明该方法的精密性良好。显色稳定性试验结果RSD为0.863%，根据不同时间间隔测得的吸光度可知，在该试验条件下显色产生的亮黄色络合物比较稳定，可用来做定量分析。用上述方法对不同时间不同地点采摘的犁头草进行检测发现，安康市镇坪县的犁头草总黄酮含量高达50.98%，3—5月犁头草中的黄酮类物质随着生长不断积累增加。
研究采用75%乙醇为溶剂，渗漉法提取犁头草中有效成分，粗提取物总黄酮含量高达16.31%，有效成分保留率为72.89%，产品纯度高，是理想的犁头草黄酮粗提取工艺。采用系统分离法分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对犁头草提取物进行萃取，检测可知正丁醇萃取物中黄酮类物质的含量为27.56%，乙酸乙酯萃取物中黄酮类物质的含量高达73.42%。萃取分离得到的犁头草黄酮纯度高，黄酮类化合物主要集中在乙酸乙酯部分，这为进一步研究犁头草有效成分和相关保健产品的开发提供了基础依据。
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