槲皮素-3-氧-酰基酯的合成及其生物活性

汪 雷，马 琛，高海立，徐 涛

(浙江理工大学 生命科学学院，浙江 杭州 310018)

槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羟基黄酮)是一种黄酮醇类化合物，广泛存在于洋葱、苹果、槐米等植物中[1-4]。槲皮素具有抗氧化[5]、抗炎[6]、舒张血管[7]、降血压[8]、抗肿瘤[9-11]等多种生物活性，其抗肿瘤活性现已成为国内外研究的热点[12]。然而，槲皮素口服的生物利用度较低。作为一种先导化合物，对槲皮素进行结构修饰，可得到许多高活性的槲皮素衍生物，槲皮素酯就是其中重要的一类[13]。槲皮素属于多官能团化合物，存在多个可以修饰的位点，本文重点讨论其3位羟基的修饰。

Domingo等[14]合成的槲皮素-3-氧-乙酰酯、Saija等[15]合成的槲皮素-3-丙酸酯等酯类化合物，均具有较好的抗氧化性和光保护性，可以作为光保护剂的候选化合物。与母核槲皮素相比，槲皮素3位用短链取代能改善其水溶性。Gatto等[16]合成了8个槲皮素-3-氧-酰酯衍生物。与槲皮素相比，槲皮素-3-氧-酰基酯类衍生物抗酯酶活性要高，且具有较好的药代动力学特性，是一种潜在的新型抗菌药。此外，槲皮素3位酯化修饰产物可以成为槲皮素的前药。Montenegro等[17]对槲皮素3位进行酯化修饰，其中2个槲皮素3位酰酯类衍生物具有合适的脂/水分配系数，在水中稳定，能迅速被酶水解释放出槲皮素，是一种新型槲皮素前药。Thapa等[18]合成了槲皮素-3-氧-没食子酸酯，具有抵抗流感A型病毒的活性。与槲皮素相比，槲皮素3位以N,N-二甲基氨基甲酰基取代，其水溶性增强14倍，且不易发生非酶水解，是一种新型的槲皮素前药[19]。Huang等[20]对槲皮素3-位羟基进行氨基酸酯化修饰，得到15种槲皮素-3-氧-氨基酸酯，能高选择性地抑制酪氨酸激酶。Fraisse等[21]合成的槲皮素-3-氧-苯基异氰酸酯，能有效抑制慢性骨髓白血病细胞K562和结肠癌细胞CT26的增殖，药效分别是槲皮素的73倍和308倍。

本研究以芦丁为原料，以苄氯对其7位、3′位和4′位(图1)羟基进行苄基化保护，然后在酸性醇溶液中水解脱去芦丁糖，得到中间体1(7,3′,4′-氧-三苄基槲皮素)，中间体1与羧酸发生Steglich酯化反应，进一步脱去苄基后得到槲皮素酯类衍生物，共合成得到7个目标化合物，其结构经核磁、质谱确证。通过抗氧化和抗肿瘤活性试验，从中筛选出活性优于槲皮素的化合物，并对构效关系作初步总结。

图1 槲皮素的结构

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV2550紫外-可见分光光度计，日本岛津；iS10 FT-IR红外光谱仪，美国尼高力；400 MHz核磁共振仪，美国Brucker；Esquire3000质谱仪，美国Brucker；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

槲皮素、芦丁，河南平舆馨星生化有限公司。氯化苄，重蒸供用。二氯甲烷，加入氢化钙回流2 h，蒸馏，密封备用。1,1-二苯-2-苦基肼(DPPH)，上海晶纯试剂有限公司；邻二氮菲，天津市化学试剂三厂。所用试剂和溶剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 清除羟基自由基

按文献[22]方法，有所修改。损伤管的加样顺序如下：在10 mL具塞试管中依次加入1 mL 0.75 mmol·L-1邻二氮菲水溶液、2 mL 0.15 mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH值7.4)和0.5 mL蒸馏水，混匀。然后加入新鲜配制的0.75 mmol·L-1的FeSO4溶液1 mL，混匀，再加入0.01%的过氧化氢1 mL，37 ℃水浴保温60 min后，在536 nm测吸光值(D0)。样品管加样顺序同上所述，仅以0.5 mL供试液替代损伤管中的蒸馏水，在536 nm处测吸光值(D1)。未损伤管加样顺序同样品管，但以1 mL蒸馏水代替损伤管中0.01%过氧化氢，于536 nm处测吸光值(D2)。以槲皮素为阳性对照。计算自由基清除率(ROH)及自由基半数清除率(SC50)。

ROH=100(D1—D0)/(D2—D0)。

1.2.2 清除DPPH自由基

参照文献[23]方法，在5 mL具塞试管中加入供试液1 mL，再加入3 mL 0.1 mmol·L-1的DPPH溶液，摇匀，避光放置30 min，在517 nm处测吸光值Dy。空白对照组加样顺序同上，仅以1 mL无水乙醇替代供试液，测吸光值为Ds，供试液组加样顺序同上，仅以3 mL无水乙醇溶液替代DPPH溶液，测吸光值为DT，计算DPPH自由基清除率(RDPPH)及SC50。

RDPPH=100[1—(Dy—DT)/Ds]。

1.2.3 细胞试验

用MTT法检测不同浓度槲皮素及其酯类化合物对EC109细胞、MGC-803细胞、EC9706细胞、PC-3细胞增殖的抑制作用。取对数生长期细胞，接种于96孔培养板中，每孔200 μL，置于体积分数5% CO2、饱和湿度37 ℃的培养箱中培养。待细胞贴壁，试验组加入RPMI1640培养基稀释的槲皮素酯类衍生物至终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μg·mL-1，溶剂对照组中加入培养基，每孔终体积为200 μL，每组设6个复孔。72 h后，取出培养板于倒置显微镜下进行形态学观察并拍照。每孔再加入20 μL 5 mg·mL-1MTT继续培养4 h，弃去原培养液后，用PBS清洗每孔，每孔各加入150 μL DMSO，晃匀使沉淀溶解，室温下静置约20 min(溶液呈紫红色)，将96孔板置于酶标仪上在492 nm波长处测各孔光密度值，计算各组的生长抑制率及半抑制浓度(IC50)。

1.3 化合物合成

1.3.1 中间体1(7,3′,4′-氧-三苄基槲皮素)的合成

按文献[24]的方法，有所改进。取芦丁2.44 g(4.0 mmol)溶于20 mL 二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1.93 g(14.0 mmol)无水碳酸钾和催化剂碘化钾搅拌，冰浴条件下，缓慢滴加1.6 mL(14.0 mmol)新蒸馏的氯化苄，缓慢升温至室温，搅拌过夜(约12 h)，TLC监测反应。待反应完全，加入冰醋酸将反应液调至pH值6，再向其中加入200 mL蒸馏水，有大量沉淀析出，继续搅拌1 h后，沉淀聚集于瓶底，弃去上清液。向沉淀中加入60 mL 95%乙醇，水浴加热至固体完全溶解，一次性加入10 mL浓盐酸，加热回流，15 min后开始有黄色沉淀产生，1 h后反应结束。冷却，冰箱放置过夜，过滤，烘干，得粗品，用三氯甲烷/甲醇重结晶，干燥，得到黄色固体，产率78%。熔点(M.p)：188.3～190.1 ℃(文献值188～190 ℃[24])。1H核磁共振(1H NMR)(400 MHz, DMSO)δ 12.42 (s, 1H, 5-OH)，9.72 (s, 1H, 3-OH)，7.90 (s, 1H, 2′-H)，7.85 (d,J=8.7 Hz, 1H, 6′-H)，7.32～7.40 (m, 15H, 3×OCH2C6H5)，7.25 (d,J=8.7 Hz, 1H, 5′-H)，6.67 (d,J=2.1 Hz, 1H, 8-H)，6.26 (d,J=2.1 Hz, 1H, 6-H)，5.21 (s, 4H, 2×OCH2C6H5)，5.11 (s, 2H, OCH2C6H5)。红外光谱(IR)(KBr)：3 290、1 651、1 616、1 593、1 504、1 455、1 306、1 258、997、749 cm-1。

1.3.2 槲皮素酯类衍生物(3)的合成

槲皮素-3-氧-乙酸酯(3a)的制备。取7,3′,4′-氧-三苄基槲皮素-3-氧-乙酸酯0.614 g(2.0 mmol)溶于二氯甲烷/甲醇混合溶剂中，加入Pd/C(浓度为10%)催化剂0.159 g，室温0.4 MPa压力条件下，加氢反应6 h，TLC监测反应。反应结束后，过滤，滤除Pd/C，滤液减压蒸馏回收溶剂，得到固体，以氯仿-甲醇(体积比20∶1)为洗脱剂，过硅胶柱，得到淡黄色固体，产率60.0%。M.p：196.6～198.2 ℃。电喷雾-质谱(ESI-MS)：343 [M-H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.23 (s, 1H, 5-OH)，10.78 (s, 1H, 7-OH)，9.77 (s, 2H, 3′-OH, 4′-OH)，7.35 (d,J=2.2 Hz, 1H, 2′-H)，7.29 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.93 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.48 (d,J=1.9 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=1.9 Hz, 1H, 6-H)，2.35 (s, 3H, CH3CO)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.37，168.49，165.12，161.52，157.05，156.33，149.78，145.95，130.05，120.98，120.06，116.49，115.39，103.89，99.53，94.54，20.78。IR(KBr)：3 327、1 753、1 651、1 602、1 567、1 489、1 357、1 306、1 183、939、793 cm-1。

槲皮素-3-氧-丙酸酯(3b)的制备。制备方法同3a。3b为黄色固体，产率46.0%。M.p：193.7～195.4 ℃。ESI-MS：357.0 [M-H]+，381.1 [M+Na]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.22 (s, 1H, 5-OH)，11.04 (s, 1H, 7-OH)，9.96 (s, 1H, 3′-OH)，9.65 (s, 1H, 4′-OH)，7.33 (d,J=2.2 Hz, 1H, 2′-H)，7.28 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.92 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5-H)，6.48 (d,J=2.0 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=2.0 Hz, 1H, 6-H)，2.68 (q,J=7.5 Hz, 2H, CH2COO)，1.15 (t,J=7.5 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (101 MHz, MeOD) δ 175.78，172.06，164.84，161.58，157.19，156.88，148.95，145.18，129.98，120.81，120.58，115.12，114.77，103.84，98.81，93.73，26.68，7.85。IR(KBr)：3 476、3 127、1 756、1 654、1 604、1 513、1 454、1 367、1 286、1 194、1 086、792 cm-1。

槲皮素-3-氧-丁酸酯(3c)的制备。制备方法同3a。3c为黄色固体，产率62%。M.p：206.6～208.5 ℃。ESI-MS：373.1 [M+H]+，395.1 [M+Na]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.24 (s, 1H, 5-OH)，11.02 (s, 1H, 7-OH)，9.91 (s, 1H, 3′-OH)，9.55 (s, 1H, 4′-OH)，7.33 (d,J=1.3 Hz, 1H, 2′-H)，7.27 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.91 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.48 (d,J=2.0 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=2.0 Hz, 1H, 6-H)，2.63 (t,J=7.2 Hz, 2H, CH2COO)，1.66 (dd,J=14.6, 7.3 Hz, 2H, CH2CH2COO)，0.95 (t,J=7.4 Hz, 3H, CH3CH2CH2COO)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，170.91，165.07，161.55，157.06，156.46，149.72，145.93，130.03，120.98，120.09，116.39，115.48，103.92，99.51，94.53，35.41，18.33，13.77。IR(KBr)：3 372、3 073、2 968、2 878、1 750、1 735、1 597、1 533、1 449、1 377、1 295、1 197、993、846、603 cm-1。

槲皮素-3-氧-戊酸酯(3d)的制备。制备方法同3a。3d为黄色固体，产率62.5%。M.p：209.6～211.5 ℃。ESI-MS：385.0 [M-H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.23 (s, 1H, 5-OH)，11.03 (s, 1H, 7-OH)，9.91 (s, 1H. 3′-OH)，9.54 (s, 1H, 4′-OH)，7.32 (d,J=2.2 Hz, 1H, 2′-H)，7.26 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.91 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.48 (d,J=2.0 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=2.0 Hz, 1H, 6-H)，2.64 (t,J=7.3 Hz, 2H, CH2COO)，1.68～1.56 (m, 2H, CH2CH2COO)，1.35 (dd,J=15.0, 7.5 Hz, 2H, CH2CH2CH2COO)，0.89 (t,J=7.3 Hz, 3H, CH3CH2CH2CH2COO)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，171.02，165.07，161.54，157.06，156.48，149.72，145.93，130.03，120.98，120.07，116.37，115.48，103.92，99.51，94.53，33.28，26.85，21.93，14.04。IR(KBr)：3 416、3 301、2 961、2 864、1 748、1 659、1 614、1 513、1 444、1 358、1 239、1 196、1 002、850、594 cm-1。

槲皮素-3-氧-庚酸酯(3e)的制备。制备方法同3a。3e为黄色固体，产率67.1%。M.p：195.9～197.1 ℃。ESI-MS：413.2 [M-H]+，437.1 [M+Na]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.24 (s, 1H, 5-OH)，10.98 (s, 1H, 7-OH)，9.90 (s, 1H, 3′-OH)，9.56 (s, 1H, 4′-OH)，7.32 (d,J=2.1 Hz, 1H, 2′-H)，7.26 (dd,J=8.4, 2.1 Hz, 1H, 6′-H)，6.91 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.47 (d,J=1.9 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=1.9 Hz, 1H, 6-H)，2.63 (t,J=7.3 Hz, 2H, CH2COO)，1.70～1.56 (m, 2H, CH2CH2COO)，1.36～1.17 [m, 6H, (CH2)3],0.85 (t,J=6.6 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，171.02，165.07，161.55，157.05，156.48，149.73，145.93，130.03，120.98，120.06，116.33，115.48，103.92，99.50，94.52，33.57，31.33，28.43，24.74，22.42，14.33。IR(KBr)：3 304、2 930、2 857、1 745、1 658、1 612、1 513、1 443、1 357、1 275、1 196、1 002、850 cm-1。

槲皮素-3-氧-壬酸酯(3f)的制备。制备方法同3a。3f为黄色固体，产率60%。M.p：197.3～198.7 ℃。ESI-MS：441 [M-H]+，443 [M+H]+;1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.25 (s, 1H, 5-OH)，10.95 (s, 1H, 7-OH)，9.96 (s, 1H, 3′-OH)，9.61 (s, 1H, 4′-OH)，7.33 (d,J=2.2 Hz, 1H, 2′-H)，7.26 (dd,J=8.4, 2.2 Hz, 1H, 6′-H)，6.91 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.47 (d,J=2.0 Hz, 1H, 6-H)，6.25 (d,J=2.0 Hz, 1H, 8-H)，2.63 (t,J=7.3 Hz, 2H, CH2COO)，1.70～1.56 (m, 2H, CH2CH2COO)，1.27 (dd,J=20.9, 9.8 Hz, 10H, (CH2)5)，0.84 (t,J=6.8 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，171.00，165.08，161.56，157.05，156.45，149.74，145.93，130.04，120.97，120.06，116.33，115.46，103.91，99.50，94.51，33.57，31.67，29.08，29.02，28.76，24.78，22.55，14.42。IR(KBr)：3 415、3 302、2 926、2 855、1 746、1 659、1 614、1 513、1 444、1 359、1 240、1 196、1 002、851、668 cm-1。

槲皮素-3-氧-硬脂酸酯(3g)的制备。制备方法同3a。3g为黄色固体，产率56.9%。M.p：208.3～210.6 ℃。ESI-MS：600 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.24 (s, 1H, 5-OH)，10.98 (s, 1H, 7-OH)，9.83 (s, 1H, 3′-OH)，9.52 (s, 1H, 4′-OH)，7.33 (d,J=2.1 Hz, 1H, 2′-H)，7.26 (dd,J=8.4, 2.1 Hz, 1H, 6′-H)，6.90 (d,J=8.4 Hz, 1H, 5′-H)，6.47 (d,J=1.8 Hz, 1H, 8-H)，6.25 (d,J=1.8 Hz, 1H, 6-H)，2.62 (t,J=7.2 Hz, 2H, CH2COO)，1.62 (d,J=7.4 Hz, 2H, CH2CH2COO)，1.49～1.09 (m, 28H, 14×CH2)，0.83 (t,J=6.7 Hz, 3H, CH3)。13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 175.41，170.93，165.08，161.60，157.05，156.42，149.74，145.95，130.08，120.93，120.10，116.32，115.47，103.93，99.49，94.48，33.60，31.77，29.54，29.50，29.41，29.32，29.20，24.78，22.56，14.36。IR(KBr)：3 395、2 981、2 904、1 719、1 682、1 606、1 527、1 440、1 367、1 288、1 182、846、771、700 cm-1。

2 结果与分析

2.1 反应路线设计

相关研究[25]表明，芦丁溶于DMF，在加热条件下与氯化苄反应3 h，薄层层析(TLC)显示有多个斑点，且后处理过程中产生很多褐色的黏稠状固体。这可能是多元酚在碱性环境中加热，发生了氧化或者聚合的副反应。虽然经过相关分离手段也得到了7,3′,4′-氧-三苄基槲皮素，但产率较低。在文献[26]的基础上，改进试验条件：在室温下，将芦丁溶于DMF，加入3.5倍芦丁质量的氯化苄，搅拌反应过夜。一方面，可以避免原料自身的聚合反应；另一方面，低温不易破坏5-羟基与4-羰基形成的氢键，使得最终产物以三保护为主，存在少部分二保护产物。通过氯仿/甲醇重结晶，得到较纯的中间体7, 3′, 4′-氧-三苄基槲皮素。加入羧酸酯化得到图2中2a～2g，催化氢解脱保护基得到目标产物(图2中3a～3g)。

2.2 对羟基自由基的清除能力

从表1可知，除化合物3f和3g外，其余化合物在试验浓度下，对羟基自由基的清除率均能达到70%以上，且清除率随浓度增大呈明显上升趋势。从半数清除率(SC50)来看，化合物3a和3b的SC50均小于282.5 μmol·L-1，低于母药槲皮素。并且发现槲皮素3位以4个碳以下的短链脂肪酸取代，将有利于其活性增强。通过比较化合物3a～3g，发现随着脂肪烃碳链的延长，其清除羟基自由基的活性大体呈现出越来越差的趋势。

2.3 对DPPH自由基的清除能力

从表2可知，新合成的7个槲皮素酯类化合物除3g外，对DPPH自由基均具有一定的清除效果，并且呈现一定的量效关系。其中，3a、3b、3c的SC50均小于槲皮素的18.8 μmol·L-1。这表明以4个碳以下的脂肪酸取代槲皮素3位羟基，有利于增强其清除DPPH自由基的能力。

(1)DMF为溶剂，加入碳酸钾，搅拌下滴加氯化苄；(2)乙醇为溶剂，滴加浓盐酸；(3)二氯甲烷为溶剂，加入二环己基碳二亚胺和DMAP；(4)甲醇二氯甲烷溶液(V∶V 1∶1)为溶剂，10%Pd/C为催化剂，催化加氢图2 槲皮素酯类衍生物的合成路线

化合物取代基团不同浓度下对羟基自由基的清除率/%20mg·L-150mg·L-1100mg·L-1200mg·L-1300mg·L-1SC50/(μmol·L-1)3aCH3CO—11.831.458.677.992.6265.23bCH3CH2CO—15.436.755.382.495.8266.23cCH3CH2CH2CO—5.019.943.381.990.1297.33dCH3(CH2)2CH2CO—1.26.730.156.988.0398.33eCH3(CH2)4CH2CO—5.617.226.666.577.3389.53fCH3(CH2)6CH2CO—6.614.633.547.265.9461.03gCH3(CH2)15CH2CO—1.75.320.342.143.1554.1槲皮素H15.733.865.085.896.3282.5

表2 不同浓度的槲皮素-3-氧-酰基酯类化合物对DPPH自由基的清除率效果

槲皮素的抗氧化活性以B环上的邻二酚羟基活性最高。这是因为当B环羟基与自由基作用后，产生的自由基可以借助形成分子内氢键得以稳定，而且还可以通过共振形成苯醌，从而降低内能，提高稳定性。槲皮素酯类衍生物具有清除自由基活性的作用：一方面，归因于槲皮素所具有的大π键共轭体系；另一方面，由于对槲皮素3位进行结构修饰，保留了槲皮素B环具有活性的儿茶酚结构，引入的之类取代基，能扩大整个分子的共轭体系，从而稳定与自由基反应后生成的中间体，因而抗氧化能力得到改善。

2.4 抗肿瘤活性

从表3可知，槲皮素对EC109和EC9706细胞的抑制作用相对较好，而对其他2种细胞的IC50值均大于128 μg·mL-1。合成的7种槲皮素酯类衍生物对这4种癌细胞均有不同程度的抑制作用，但总体来看，普遍对人胃癌细胞MGC-803有较好的抑制作用。构效关系分析表明，槲皮素3位以脂肪链取代时，随着碳链延长，其对EC109细胞的抑制效果增强(图3)。

虽然新合成的7个槲皮素酯类化合物对于人食管癌细胞EC109的作用均弱于槲皮素，但是普遍对人胃癌细胞MGC-803表现出较好的抑制作用(表3)。其中化合物3f的IC50可以达到8.24 μg·mL-1。化合物3b对人前列腺癌细胞PC-3的抑制效果最好，IC50达到6.94 μg·mL-1，明显优于母核槲皮素。槲皮素3位以大于7个碳原子长度的脂肪酸取代，有助于提高对人胃癌细胞MGC-803的抑制作用。

表3 槲皮素-3-氧-酰基酯类化合物对不同肿瘤细胞的增殖抑制率

图3 槲皮素3位取代碳链长短与对EC109细胞抑制作用的关系

3 小结

以廉价的芦丁为原料，利用Williamson反应保护槲皮素7,3′,4′位羟基，经酸水解、Steglich酯化、催化加氢脱苄基，合成了7个槲皮素酯类衍生物，所有化合物均经过红外、核磁、质谱确证。与现有的其他路线相比较，该路线具有选择性高、反应条件温和、操作简单、适于规模化生产的优点。初步构效关系研究发现，槲皮素3位以4个碳以下的短链脂肪酸取代有利于增强其抗氧化活性，而以长链脂肪酸取代有利于改善其抗肿瘤活性。采用MTT法评价了槲皮素及其7种衍生物对4种癌细胞的增殖抑制作用，结果表明，3e和3f对人胃癌细胞MGC-803的IC50值分别达9.35和8.24 μg·mL-1，远小于槲皮素，有望进一步研究成为抗胃癌的候选药物。

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