大青龙汤抗病毒有效物质部位血清药化分析

周国威 张梦琳

【摘要】 目的 分析大青龙汤抗病毒有效物质部位血清药化。方法 对给药大鼠进行大青龙汤抗病毒有效部位正丁醇萃取物灌胃， 并应用高效液相色谱法（HPLC）对其中的含药血清指纹图谱进行分析、测定， 同时还需要深入分析和研究空白血清与大青龙汤正丁醇萃取物入血成分之间存在的差异。结果 通过分析、对比大青龙汤正丁醇萃取物含药血清和空白血清色谱图可以看出， 除去空白血清中所含指纹峰， 在给药30 min后出现较多的含药血清指纹峰， 且峰值都相对较高， 共有45个峰， 其中原型成分25个，

2个指纹峰被分别指认为甘草苷与甘草酸单铵盐。结论 通过分析比较大青龙汤抗病毒有效部位正丁醇萃取物入血成分以及相应的指纹图谱发现， 其入血成分的指纹峰比较多， 且两者还存在着大量的对应指纹峰， 这表示其有效成分发挥作用主要是原型或代谢物进入到体内发挥出相应的药效， 可据此深入分析该处方的抗病毒药效。

【关键词】 大青龙汤;抗病毒有效物质部位;血清药化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2018.07.118

大青龙汤是《伤寒论》中的经典方剂， 其中包括石膏、生姜、大枣、炙甘草、苦杏仁、桂枝、麻黄几味药材， 具有独特的内清里热、外散表寒功效， 在郁热内聚、寒邪外束的伤寒兼里热烦躁症当中都得到有效应用， 目前在临床中多被应用于急性肾炎、哮喘、慢性支气管炎合并肺部感染、无汗症、高热症、感冒等急症治疗中， 并获得良好的应用效果[1]。本研究分析大青龙汤抗病毒有效物质部位血清藥化。

1 材料与方法

1. 1 材料 仪器：1100型HPLC仪、XW-80A型涡旋混合器、KQ3200DE型超声波清洗仪、AL204型1/10000分析天平、BP-211D型1/100000分析天平、BF2000-15A型15孔改进型氮吹仪、TGL-16G型离心机[2]。试药：实验室自制的正丁醇部位萃取物， 以及某食品药品检定研究院提供的甘草酸单铵盐、甘草苷， 色谱纯为甲醇和乙腈， 分析纯为磷酸， 超纯氮气。试验动物：SPF级SD大鼠， 均为雄性， 体质量230～270 g[3]。

1. 2 方法

1. 2. 1 液相色谱条件 色谱柱为Aglient ZORBAX SB-C18柱， 5 μm， 规格与流动相分别为250 mm×4.6 mm和0.05%磷酸水（A）-乙腈（B）， 分析时间为85 min， 流速和柱温分别控制在0.8 ml/min、25℃， 进样量为15μl， 检测波长为250 nm。

1. 2. 2 制备供试品溶液

1. 2. 2. 1 制备大青龙汤正丁醇萃取物供试液 精确称量出0.1008 g上面得到的正丁醇萃取物样品， 放入量瓶中， 然后将适量甲醇溶液加入到量瓶当中， 超声溶解量瓶当中的混合物， 并完成定容、摇匀步骤操作。对量瓶当中的2 ml甲醇溶液定容， 达到标准刻度后用0.45 μm微孔滤膜过滤， 进而完成供试品溶液制备工作。

1. 2. 2. 2 制备大青龙汤正丁醇萃取物灌胃液 在大青龙汤正丁醇部位提取适量的萃取物， 溶解到注射用水当中， 将其配置成0.6 g/ml的混悬液， 为后续实验操作做好准备。

1. 2. 2. 3 制备大青龙汤正丁醇萃取物 将一定量的乙醇溶液70%加入到大青龙汤药材处方当中， 并分别进行两次提取， 然后再合并两次提取到的提取液， 浓缩， 然后分别萃取正丁醇、醋酸乙酯、氯仿、石油醚， 合并得到的正丁醇萃取液， 浓缩， 减压干燥后就能够得到大青龙汤正丁醇萃取物[4， 5]。

1. 2. 3 制备对照品供试液 称取出1.03 mg甘草苷对照品， 1.05 mg甘草酸单铵盐对照品， 加入甲醇后超声溶解， 制备出对照品供试液。

1. 2. 4 制备和处理含药血清

1. 2. 4. 1 给药与采血 将15只SD大鼠按照随机分配原则分为五组， 其中4组是给药组， 1组是空白组。给药组大鼠需要按照1.5 ml/100 g的剂量给药， 3次/d， 在给药前12 h需要禁食， 末次给药的时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0 h， 从大鼠眼眶中分别取出1 ml血液。空白组大鼠用注射用水进行灌胃， 其具体的操作方法与上述相同， 在最后一次灌胃后一次性取血。最后将所有得到的血液进行离心处理， 3000 r/min， 离心10 min， 将血清分离后放入到-20℃的冰箱中冷藏备用。

1. 2. 4. 2 血清样品处理 将每一小组相同时间提取的大鼠含药血清合并， 混合均匀， 从中量取出1 ml血清， 将3 ml乙腈加入其中， 涡旋混合10 min， 离心处理10 min， 15000 r/min， 取出上述得出的清液适量， 并用40℃氮气吹干。在剩下的残渣当中加入100 μl甲醇， 简单混合后还需要进行10 min涡旋混合， 离心10 min， 15000 r/min， 用0.45 μm微孔过滤膜过滤， 得出的过滤液就是含药血清供试品溶液[6]。用相同的方法处理空白组大鼠血清。

1. 2. 4. 3 分析大青龙汤正丁醇萃取物含药血清成分分析

在相同色谱条件下对相等量的空白血清、含药血清、对照品、大青龙汤正丁醇萃取物进行HPLC分析， 并根据结果建立HPLC特征指纹图谱， 对其中的移行成分差异进行分析， 将对照品色谱峰作为标准分析各特征指纹图谱中色谱峰成分。

2 结果

采用HPLC色谱图分析大青龙汤正丁醇萃取物， 最终得出了40个色谱峰。见图1。通过分析、对比大青龙汤正丁醇萃取物含药血清和空白血清色谱图可以看出， 除去空白血清中所含指纹峰， 在给药30 min后出现较多的含药血清指纹峰， 且峰值都相对较高， 共有45个峰， 其中有25个几乎与正丁醇物质部位色谱峰tR保持一致， 这可能是药物入血原型成分， 其中17号色谱峰对应甘草苷对照品色谱峰， 41号色谱峰对应甘草酸单铵盐对照品色谱峰， 这样就表示都属于甘草苷和甘草酸单铵盐。剩下的20个色谱峰则可能会应激产物或代谢产物。