水飞蓟油的体外抗氧化活性及对氧化损伤小鼠的保护作用

朱淑云，周 越，肖 香，董 英，朱胜虎

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.江苏恒顺集团有限公司，江苏 镇江 212143）

水飞蓟（Silybum marianum L. Gaertn.）为菊科水飞蓟属草本植物，原产于地中海沿岸，现亚洲、欧洲、南北美洲等地均有种植。水飞蓟是一种优良的药用植物和油料植物。其药用有效成分水飞蓟素主要在水飞蓟籽壳中[1]，籽仁中蛋白质和油的含量较高，水飞蓟籽的含油率一般在20%～30%左右。目前国内外对水飞蓟的研究主要集中在水飞蓟素的提取、纯化及其生物活性的研究上，而对其副产物水飞蓟油的研究较少，致使水飞蓟油的开发利用相对滞后[2-4]。研究发现，水飞蓟油中不饱和脂肪酸含量高达75%以上（以亚油酸为主），且富含VE，此外还含有β-谷甾醇、豆甾醇等固醇类成分，具有很高的营养价值[5-6]。研究表明水飞蓟油具有较好的降血脂、抗肝中毒和预防肝病的作用[7-9]。安全性实验表明，水飞蓟油无致突变、致畸作用，无明显亚慢性毒性[10-11]，且被国家卫生部在2014年第6号公告中批准为新资源食品。

大量研究证明，自由基的氧化损伤与许多疾病有关，人体通过适当摄入抗氧化物质可以降低体内自由基水平，防止脂质过氧化的发生，从而帮助机体抵御疾病。但目前应用于食品中的人工合成抗氧化剂二丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、叔丁基羟基茴香醚（butylated hydroxy anisol，BHA）等被发现有不同程度的副作用，因此人们迫切希望从自然界中寻找高效安全的天然抗氧化剂，而水飞蓟油中含有许多抗氧化活性很强的物质，如VE和固醇类物质，但现有关水飞蓟油抗氧化活性的研究鲜有报道；因此本实验研究了水飞蓟油的体外抗氧化活性，并进一步研究了水飞蓟油对氧化损伤小鼠的保护作用，以期为水飞蓟油的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

3 月龄ICR小鼠40 只，购于江苏大学实验动物中心，许可证号：SCXK（苏）2013-0011，所有小鼠均饲养于江苏大学实验动物中心动物房内。

水飞蓟油由水飞蓟籽仁通过低温加压溶剂萃取技术（0.2 MPa压力），以液化丁烷为溶剂常温制得；橄榄油市售。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美国Sigma公司；D-半乳糖美国Amresco公司产品；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等试剂盒 南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

加压溶剂萃取装置 江南集团与江苏大学联合研制；FC-160型锤式粉碎机 上海中药机械厂；L500离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；T8电动均浆器德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 清除DPPH自由基能力的测定

清除DPPH自由基能力的测定参照文献[12-13]，用无水乙醇配制质量浓度分别为10、15、20、25、30、50 mg/mL的水飞蓟油作为待测样品备用。取2 mL待测样品加入2 mL 0.04 g/L的DPPH无水乙醇溶液，混合均匀，反应20 min，测其在517 nm波长处吸光度，记为A1；另取2 mL待测样品加入无水乙醇2 mL，反应20 min，测其在517 nm波长处吸光度，记为A2；再测定2 mL 0.04 g/L DPPH无水乙醇溶液和2 mL无水乙醇在517 nm波长处吸光度A0。所有测定平行进行3 次，取平均值。按照式（1）计算水飞蓟油对DPPH自由基的清除率。

1.3.2 清除羟自由基能力的测定

清除羟自由基能力的测定参照文献[14]，将水飞蓟油用无水乙醇配制成质量浓度分别为5、10、15、20、25 mg/mL的样品备用。取2 mL水飞蓟油，依次加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4和H2O2，混匀后静置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水杨酸，混匀，静置30 min，测其510 nm波长处吸光度记为Ai，用蒸馏水代替水杨酸的吸光度记为Aj。以蒸馏水代替水飞蓟油的吸光度记为A0。每个样品测定3 次，取平均值。按照式（2）计算水飞蓟油对羟自由基的清除率。

1.3.3 T-AOC的测定

[15-16]的方法，将水飞蓟油用无水乙醇配制成质量浓度分别为0.5、1.5、2.0、4.0、6.0 mg/mL的样品备用。取0.4 mL水飞蓟油，加入4 mL磷钼酸试剂（28 mmol/L磷酸钠、0.6 mol/L浓硫酸和4 mmol/L钼酸铵），95 ℃恒温水浴90 min，测定695 nm波长处吸光度。每个样品测定3 次，取平均值。

1.3.4 实验动物分组

将小鼠按体质量随机分为4 组（正常组、模型组、水飞蓟油组、橄榄油组），每组10 只，经1 周适应性饲养后，正常组小鼠腹腔注射生理盐水，其他组小鼠均腹腔注射D-半乳糖500 mg/（kg·d）（以体质量计，下同），第3、4组小鼠分别灌胃10 mL/（kg·d）剂量的水飞蓟油和橄榄油，正常组和模型组灌胃等量蒸馏水。实验期间小鼠自由饮水、自由采食，每天固定时间注射和灌胃，连续饲喂7 周。实验结束后，采血，引颈处死小鼠，迅速取肝组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸去水分后，以电子天平准确称取质量，置洁净塑料袋中密封，超低温保存。

1.3.5 血清中抗氧化酶活力和T-AOC的测定

小鼠血1 500 r/min离心15 min，取上层血清按试剂盒要求测定SOD、GSH-Px、T-AOC水平。

1.3.6 组织形态学检测

1.3.6.1 光学显微镜下观察组织形态

取小鼠肝组织用10%中性福尔马林溶液固定，经乙醇梯度脱水，二甲苯透明处理，石蜡包埋，连续切片，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察。

1.3.6.2 肝组织细胞超微结构观察

取小鼠肝组织切割成1 mm3的组织块，立即投入2.5%戊二醛溶液进行前固定，然后用磷酸盐缓冲溶液清洗数次，再经过1%锇酸溶液后固定，丙酮系列脱水，环氧树脂包埋，切片后用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电子显微镜下观察。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 水飞蓟油对DPPH自由基的清除能力

图1 水飞蓟油对DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging effect of Silybum marianum seed oil on DPPH radicals

由图1可看出，在10～50 mg/mL的质量浓度范围内，水飞蓟油对DPPH自由基的清除率随着质量浓度升高而逐渐增大，几乎呈线性关系，表现出良好的量效关系。其IC50为33.68 mg/mL，比莲子胚芽油（IC50＝48.90 mg/mL）[17]和甜橙油（IC50＝66.10 mg/mL）[18]等植物油的低，与山茶油相近（IC50＝35.13 mg/mL）[19]，表明其具有较强的清除DPPH自由基的能力。

2.2 水飞蓟油对羟自由基的清除能力

图2 水飞蓟油对羟自由基的清除率Fig.2 Scavenging effect of Silybum marianum seed oil of hydroxyl radicals

羟自由基是破坏性极强的自由基，它可以与活细胞中许多分子反应，且速度极快，从而引发各种病变，是导致疾病和衰老的主要因素[20-21]。由图2可以看出，在5～25 mg/mL范围内，水飞蓟油对羟自由基的清除率呈上升趋势，当其质量浓度为25 mg/mL时清除率达54.04%，远高于莲子胚芽油（IC50＝3.13 mg/mL）[17]，但远低于南瓜籽油（IC50＝121 mg/mL）[22]，体现了较好的羟自由基清除活性。

2.3 水飞蓟油的T-AOC

图3 水飞蓟油的T-AOCFig.3 Total antioxidant capacity of Silybum marianum seed oil

由图3可见，样品液的吸光度随质量浓度的增加而逐渐升高，表明其抗氧化活性逐渐增强，当质量浓度为6 mg/mL时其吸光度达到0.383，略低于欧李仁油和橄榄油[23]，但也说明其在体外的T-AOC较强。

2.4 水飞蓟油对小鼠体质量的影响

表1 水飞蓟油对小鼠体质量的影响（n＝10）Table1 Effect of Silybum marianum seed oil on body weight of mice (n= 10)

由表1可知，实验期间各组小鼠的体质量都有增加，但无显著性差异（P＞0.05），说明水飞蓟油和橄榄油的添加对小鼠的生长、食欲、消化及其物质代谢不存在显著影响。

2.5 水飞蓟油对小鼠血清中SOD、GSH-Px活力和T-AOC的影响

SOD是体内最有效的抗氧化剂，能清除体内超氧阴离子和各种过氧化物，防止活性氧的生成和蓄积，对机体的抗氧化水平起着非常重要的作用[24-25]。GSH-Px是体内重要的催化过氧化氢分解的酶，其能催化GSH还原过氧化氢，使过氧化氢被还原成水，从而稳定含巯基的酶，防止血红蛋白及其他辅助因子受到氧化损伤，从而减轻过氧化物对机体的损伤，保护生物体不受氧化损害[26]。而T-AOC的作用主要是维持内环境活性氧的动态平衡，清除过高的活性氧，使机体处于氧化还原相对稳定的状态，T-AOC水平的下降是造成体内活性氧水平升高的原因之一[27]。因此SOD、GSH-Px、T-AOC水平的变化可反映机体抗氧化能力的变化。水飞蓟油对小鼠SOD和GSH-Px的活力及T-AOC的影响见表2。

表2 水飞蓟油对小鼠血清中SOD、GSH-Px、T-AOC的影响（n＝ 10）Table2 Effect of Silybum marianum seed oil on SOD, GSH-Px and T-AOC in serum of mice (n= 10)

表2显示，模型组小鼠的SOD和GSH-Px活力及T-AOC显著低于正常组（P＜0.05），说明D-半乳糖可引起小鼠体内抗氧化能力的下降。水飞蓟油和橄榄油可显著提高小鼠血清中SOD和GSH-Px的活力，并能提高其T-AOC，使其达到正常组水平。说明水飞蓟油和橄榄油可提高小鼠的抗氧化能力，降低D-半乳糖对小鼠的氧化损伤，从而达到抗氧化的目的。研究发现，植物油中的VE和甾醇类物质具有很强的生物活性[28-31]，而水飞蓟油含有丰富的VE和β-谷甾醇，这也是其具有抗氧化活性的物质基础。

2.6 水飞蓟油对小鼠肝组织形态的影响

肝脏是生物体内物质代谢的重要器官，具有物质储存、代谢、解毒等多种功能，肝组织的形态变化是研究机体氧化损伤的重要指标之一。本实验结果显示：正常组小鼠肝组织细胞排列整齐，细胞结构清晰，细胞无明显肿胀；模型组小鼠肝细胞形态发生了明显的变化，细胞排列不整齐，肝细胞间没有明显的界限，细胞之间连接比较松散；水飞蓟油和橄榄油组小鼠的肝细胞形态基本与正常组一样，细胞排列整齐，无明显的肿胀（图4）。说明水飞蓟油可以对小鼠肝细胞的氧化损伤起到保护作用，这与其抗氧化活性有密切关系。

图4 水飞蓟油对小鼠肝组织形态的影响（400×）Fig.4 Effect of Silybum marianum seed oil on liver tissue morphology in mice (400 ×)

2.7 水飞蓟油对小鼠肝细胞超微结构的影响

图5 水飞蓟油对小鼠肝细胞超微结构的影响Fig.5 Effect of Silybum marianum seed oil on ultrastructure of mouse liver cells

如图5所示，正常组小鼠肝细胞的超微结构正常，细胞核呈圆形或卵圆形，核膜完整，细胞中线粒体数量多，形态正常，线粒体嵴清晰，内质网丰富；模型组细胞的超微结构发生了明显改变，部分细胞器结构不清或变形，线粒体膜损伤，结构不完整，出现肿胀变形，部分线粒体出现空泡，内质网相对减少；水飞蓟油和橄榄油组小鼠的肝细胞超微结构均接近正常组，可见细胞核膜完整，线粒体清晰，形态规则，线粒体肿胀不明显，无空泡现象。由此可见，D-半乳糖对肝细胞造成了氧化损伤，引起了线粒体结构的改变，水飞蓟油可以减轻小鼠肝细胞氧化损伤的程度，从而维持细胞超微结构的完整性，具有很好的抗氧化作用。水飞蓟油的抗氧化活性与其含有大量的不饱和脂肪酸和VE，以及β-谷甾醇、豆甾醇等固醇类成分密切相关，但具体的作用机理还有待于进一步研究。

3 结 论

水飞蓟油的体外抗氧化结果表明其具有一定的抗氧化活性，其抗氧化能力与质量浓度有较好的量效关系。水飞蓟油清除羟自由基的能力高于DPPH自由基，其总抗氧化能力较强。

水飞蓟油的体内抗氧化结果表明，水飞蓟油的抗氧化活性与橄榄油相当，可以显著提高小鼠血清中SOD、GSH-Px和T-AOC水平，说明水飞蓟油可以提高D-半乳糖氧化损伤小鼠的抗氧化能力。通过光学显微镜和透射电子显微镜观察发现水飞蓟油可以改善氧化损伤小鼠肝细胞的形态结构，保护小鼠肝细胞形态的完整性，维持细胞正常功能的发挥。

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